Дрессировка и воспитание щенка чихуахуа по месяцам

Важные этапы обучения в первый год жизни

В первый год жизни щенка чихуахуа крайне важно последовательно проходить все этапы воспитания, социализации и дрессировки. Как это сделать правильно — мы сейчас Вам расскажем.

 

С какого возраста начинать обучение?

Обучение щенка необходимо начинать с первых дней нахождения собаки в Вашем доме. Потому что уже с младенчества щенок должен узнавать правила поведения в Вашем доме, что ему разрешено, а что запрещено, как нужно вести себя со всеми членами семьи, даже самыми маленькими и пожилыми, с чем можно играть, а с чем нет, куда ходить в туалет и многое другое.

И речь идет, в первую очередь, о правильном воспитании щенка чихуахуа, а к дрессировке и изучению команд можно будет приступать, когда щенок полностью освоится в Вашем доме. Как правило, одной недели бывает достаточно. Щенок к этому времени уже переполнен любопытством и старательно познает окружающий мир. Если же по прошествии этого времени щенок остается боязливым, плохо идет на контакт, то лучше обратиться за помощью к кинологу-зоопсихологу, т.к. подобное поведение не свойственно щенкам данной породы.

 

Когда можно начинать обучение с кинологом

Начало обучения щенка совпадает со временем первого выхода на улицу. Когда две первые прививки уже сделаны, карантин (длится 7-14 дней, в зависимости от прививки) после них закончен. Совсем не обязательно заниматься с щенком только на улице, первые занятия лучше проводить дома, где меньше отвлекающих факторов.

Часто новоиспеченные владельцы щенков волнуются, что дрессировка с первых дней будет чрезмерным стрессом для собаки. Такое возможно только в случае использования устаревших жестких методик, а при правильном подходе обучение с первых дней будет наоборот очень полезно, поскольку позволяет сразу же установить контакт с щенком и выстроить доверительные отношения.

Начинать воспитание щенка можно с первых дней его появления в Вашем доме, а дрессировку и занятия с кинологом можно начинать одновременно с началом прогулок, когда закончится карантин после второй прививки.

 

Почему не нужно ждать до 6 месяцев

Часто приходится слышать, что чихуахуа, как и других собак, нельзя дрессировать до 6 месяцев, потому что дрессировка — это стресс. Такое мнение осталось со времен устаревших методик, основанных на жестоком принуждении и запугивании собаки. К сожалению, кинологов, использующих подобные методики и на сегодняшний день еще предостаточно. Но к счастью, наука не стоит на месте и современные методики позволяют обучать щенка с первых дней в новом доме. Поэтому не следует ждать, пока у Вашего щенка чихуахуа закрепится нежелательное поведение, Вы можете начинать заниматься намного раньше.

 

Дрессировка в 2 месяца. Воспитание

В 2 месяца Ваш щенок чихуахуа еще находится дома, на карантине после первых прививок, и гулять ему еще нельзя. Поэтому самое время заняться воспитанием щенка в уже привычных ему домашних условиях.

 

Приучение к туалету

Первым пунктом идет приучение щенка к хождению в туалет на пеленку. Не следует торопиться учить ходить в туалет сразу на улицу, минуя этот этап, потому что щенки физиологически не готовы к двухразовому выгулу. Такая способность у щенков чихуахуа вырабатывается не ранее 6 месяцев, а у некоторых вплоть до 1 года.

Следует помнить, что любое научение — вещь достаточно сложная и, видя первые положительные результаты, не следует думать, что Ваш щенок уже все понял, а следует продолжать приучение, согласно методике, чтобы через некоторое время не пришлось начинать все сначала.

 

Приучение к ошейнику и поводку

Вторым важным моментом будет приучение щенка к ошейнику и поводку. Да-да, этим следует заняться именно дома, чтобы к тому моменту, когда щенок в первый раз выйдет на улицу, ношение ошейника не было для него дополнительным стрессом, а являлось уже привычным делом, и он мог заняться исследованием окружающего мира, а не пытался избавиться от непонятного предмета.

 

Что разрешать щенку, а что нет

Третьим пунктом, вызывающим наибольшие сложности у новоиспеченных владельцев щенков, будет определение у щенка границ дозволенного. Зачастую многие начинающие собаковладельцы думают, что нежелательное поведение щенка чихуахуа «пройдет само, перерастет». Но, к сожалению, поведение, которое разрешено щенку, будет восприниматься, как само собой разумеющееся, в последствии и взрослой собакой.

Никакое нежелательное поведение у щенка САМО НЕ ПРОЙДЕТ, а только закрепится со временем.

Поэтому заняться определением у щенка границ дозволенного необходимо уже сейчас. Вам будет необходимо:

• Научить играть только со своими игрушками, а не с Вашими вещами;
• Объяснить, что нельзя кусать Вас за руки даже в игре;
• Установить правильный режим дня, закрепив правило, что по утрам нужно спать, а не будить Вас;
• Отучить грызть мебель, одежду, стены и плинтуса;
• Научить оставаться дома одному, зная, что Ваше отсутствие — это не повод лаять или выть.

КРАЙНЕ ВАЖНО ЗНАТЬ: постоянные и чрезмерные наказания, следующие чуть ли не за каждым действием щенка — губительно сказываются на его неокрепшей психике и могут привести к тому, что щенок чихуахуа вырастет трусливым и озлобленным. У щенка, для нормального естественного развития, должна быть возможность исследовать окружающий мир, который пока ограничен Вашей квартирой или домом.

 

Ознакомление с начальными командами

Уже сейчас следует начинать ознакомление с начальными командами послушания в легкой игровой форме, при этом делать акцент на поощрении за выполнение, ведь психика щенка еще достаточно пластична и чрезмерная строгость и требовательность могут привести к тому, что щенок будет запуганным и трусливым. Поэтому необходимо, в первую очередь, стараться заинтересовать щенка, предложив ему игрушку или лакомство, а иногда и просто похвалу.

 

Дрессировка в 3 месяца. Социализация

Три месяца — это важный этап знакомства щенка чихуахуа с окружающим миром. Ваши первые прогулки должны быть непродолжительными и не слишком утомительными для щенка. Начинать следует с 15 минут, постепенно увеличивая время прогулки до 1 часа.

 

Правильное формирование нервной системы

В этом возрасте идет формирование нервной системы щенка. Доказано, что выращивание щенков в изоляции в этот важный период способствовало развитию у них резко выраженной трусости в дальнейшем. Необходимо показать щенку как можно больше: шумные улицы, большие скопления людей и др. Все то, с чем ему предстоит сталкиваться в дальнейшей жизни.

Делать это нужно очень аккуратно, постепенно, раз за разом увеличивая время нахождения в шумных местах, чтобы не перегрузить щенка и не напугать его.

Территория загородного дома, дача или деревня являются местами с минимальным количеством внешних раздражителей для городской собаки. Поэтому, если Вы планируете содержать собаку в городской среде, «взросление» щенка чихуахуа в таких обедненных раздражителями условиях недопустимо.

Городской щенок должен взрослеть в городе, в условиях, которые насыщенны внешними раздражителями, такими как: шумные улицы, большие скопления людей, другие животные, птицы, велосипедисты, автомобили и др.

 

Знакомство с людьми и собаками

Необходимо познакомить щенка с дружелюбными собаками и людьми, чтобы в последствии у щенка не появилось агрессии или трусости, вызванной страхом нового и неумением общаться, заводить новые знакомства.

В настоящее время, к сожалению, это не редкость в поведении уже взрослых собак, а достаточно частая проблема, с которой люди обращаются за помощью к нашим специалистам.

 

Поведение щенка на улице

Появление новых мест ведет и к новым правилам, нуждающимся в закреплении:

• В туалет теперь можно и нужно ходить на улице, а не стоически терпеть, неся все домой;
• Не каждый новый человек или собака желают общения, поэтому не нужно бежать знакомиться к каждому, сломя голову;
• Не вся еда полезна, поэтому её нужно принимать только из рук хозяина.

 

Дрессировка и отработка команд

Дрессировка щенка проходит по тем же принципам, что и в 2 месяца. Следует помнить, что в этом возрасте у щенков достаточно легко вырабатываются условные рефлексы, но так же быстро и забываются, поэтому не стоит ругать щенка за невыполнение команд, особенно если их давно не повторяли, а следует уделить больше внимания изучению нового и повторению уже пройденного материала.

 

Дрессировка в 4 — 5 месяцев

К этому времени щенок чихуахуа уже освоился у Вас дома и в местах обычного выгула, уже не так сильно нуждается в Вашей поддержке и опеке. Он начинает, заигрываясь с другими собаками, делать вид, что не слышит Вас, когда Вы его зовете, проявлять определенное упорство и непослушание при выполнении различных команд.

А значит пришло самое время переходить к полноценной дрессировке. На занятиях в этом возрасте уже можно проявлять настойчивость и требовательность. При этом, самое главное — не переусердствовать, помнить, что занятия должны приносить радость как Вам, так и Вашей собаке, и только тогда Вы сможете добиться желаемого результата.

 

Необходимые команды в 4 месяца

Какие команды отрабатываются у щенка чихуахуа в 4 месяца:

• Спокойное движение рядом с хозяином с поводком и без поводка, с посадкой при остановке, со сменой темпа и направления движения
• Возвращение к Вам по команде
• Выдержка в свободном или определенном положении (сидя, лежа, стоя)
• Безразличное отношение к разбросанному на земле лакомству
• Запрещающая команда для прекращения нежелательных действий
• Выполнение комплекса команд «сидеть», «лежать», «стоять» на расстоянии и около ноги, при подаче команд голосом и жестами
• Прекращение лая по команде.

 

Дрессировка с 6 месяцев

В этом возрасте у щенка начинается половое созревание и в нем просыпается настоящий бунтарь. Он начинает заново проверять границы дозволенного и, порой, умышленно не реагирует на Ваши команды, только для того, чтобы посмотреть на Вашу реакцию. Если она будет не такой, какой щенок ожидает ее увидеть, то он может решить, что теперь можно больше не выполнять Ваши команды.

Следует помнить, что щенок

по прежнему еще остается ребенком, и чрезмерная жесткость может навсегда подорвать его доверие к Вам.

На этом этапе взросления щенка чихуахуа в дрессировке становятся отчетливо видны все недоработки, допущенные на предыдущих этапах, которые сглаживались его юным возрастом. И если они проявились — пришло время их исправлять.

Во многих школах дрессировки бытует мнение, что щенка нужно дрессировать в два этапа, первый — в раннем возрасте, а второй в 8 — 10 месяцев, чтобы «закрепить» изученное. Это не совсем верная позиция, появилось это мнение когда к старым «ДОСААФовским» жестким методикам дрессировки, где с щенком начинали работать строго после 6 — 7 месяцев, стали добавлять более новые оперантные методики обучения, включающие работу методом наведения и следования за «мишенью».

Слабость их была в том, что это две различные методики, которые начали использовать без адаптации друг к другу, имеющие огромную пропасть между их инструментами отработки навыков дрессировки. Разница между ними, как между уроками хореографии в детском саду и армейской строевой подготовкой. Поэтому им и требовалось обучение в два этапа, никак не связанных между собой.

Современные методики, позволяют обучать щенка в единой системе, когда не требуется дополнительных этапов обучения.

 

Собака чихуахуа. Содержание и уход

Иногда продают собак, помещающихся в чашке. Это не редкость, а порок. Такие собаки являются недокормленными и склонными ко многим заболеваниям.

Чихуахуа подпадают под стандарт FCI#218, принятый в 2004 году. Согласно ему, происхождение этой породы идет из Мексики, собак относят к компаньонам и миниатюрным собакам. Основная черта – череп в форме яблока, тонкий и длинный хвост и тонкие длинные конечности. Нос короткий и курносый. Челюсти сомкнуты в правильный прямой или ножницеобразный прикус без недокусов.

Глаза у чихуахуа огромные, выпуклые и должны иметь максимально темный оттенок. Хотя светлые глаза не считаются браком, но все-таки не говорят о высшей чистоте породы. Уши чихуахуа большие, закругленные и стоят в разные стороны, под углом 45 градусов к черепу.

Если шерсть по всему телу длинная, на хвосте может образовываться кисточка. Тело собаки покрыто гладкой и строго упругой кожей. Если шерсть короткая, то она блестит и прилегает по всему телу, равномерно распределена и не имеет залысин. Если длинная, она немного вьется или выпрямлена, есть небольшой подшерсток. Единственное, в чем не стесняют собак, это их окрас – он может быть абсолютно любым.

Выбор щенка чихуахуа

Чихуахуа, просто отлично подходит для содержания в квартире. Эта собака настолько удобна, что вполне может обойтись лотком. И главное преимущество данной породы это то, что ее небольшие размеры позволяют ее брать с собой, даже в дальние поездки. Она не требует особого ухода и вполне не капризничает по каждому пустяку.

Приобретая щенка чихуахуа его возраст должен быть — около 5-7 недель. Если брать щенка еще совсем молодым его чувствительность к окружающей среде может совсем плохо сказаться на психике.

Пока узнать будущие характеристики щенка чихуахуа в таком возрасте весьма сложно даже квалифицированному специалисту. Поэтому выбирая щенка, посмотрите на всех и выберите такого, который вам сразу же понравится и вам покажется, что это именно он. Нужно положится на свою интуицию.

Если вам предложили щенка чихуахуа в возрасте от 3 до 5 месяцев, не стоит сразу отклонять предложение. Если щенок вам действительно понравился, то возраст не должен помешать вам в воспитании питомца. А если вы приобретаете щенка для демонстраций на выставках, такой возраст будет только еще лучше— вы сразу же сможете оценить собаку по стандарту и выяснить какие есть недостатки, а также подкорректировать характер.

А также вы можете приобрести уже взрослую собаку. Некоторые питомники пристраивают собак которые уже завершивших карьеру в участиях на выставках. Такие собаки идеально хорошо воспитаны и отличаются своим отличным здоровьем, они смогут быстро привыкнуть к новому месту проживания и к новому хозяину. Такие взрослые собаки чихуахуа из питомника проживут еще довольно долго, и станут для вас отличным компаньоном.

Темперамент чихуахуа

У этой карликовой породы психика очень устойчива. Редко встречаются трусливые или истеричные чихуахуа. Поэтому таких маленьких собак сравнивают с отважными воинами маленького роста. Истинный чихуахуа красив, горд, смотрит свысока, несмотря на свой рост.

Собака очень любопытна и наблюдательна. Она понимает сразу, предстоит ли ей идти на прогулку или же пойти в гости. Но чихуахуа довольно обидчивы. Если хозяин прикрикнет на собаку из-за своего плохого настроения, то маленький друг просидит в своем домике целый день, пока не простит.

Порода очень темпераментная, выносливая и подвижная, может бегать подолгу по саду или по квартире, при этом проделывая невероятные трюки.

Принято считать, что длинношерстный чихуахуа более уживчивый и мягкий, чем гладкошерстный. Поскольку эта собака своему хозяину предана, она иногда может быть ревнива, но не злобна. При сильном стрессе иногда страдает непроизвольным мочеиспусканием.

Если, приобретая подобную собаку компаньона, вы рассчитываете получить игрушку, подумайте, зачем вообще нужны собаки. У этих маленьких питомцев тоже внутри спрятан хищник, они имеют свой характер, ум и волю и требуют, чтобы с ними обращались, как с собаками. Спору нет, в характере чихуахуа преобладают лучшие черты друга: добродушие, веселость, готовность к играм.

Вместе с тем, эта порода хорошо поддается дрессировке, несмотря на свой горделивый нрав. Вы обучите чихуахуа командам с легкостью, если найдете подход на равных, но с чертой хозяйского доминирования. Вас удивит грация и легкость, с которой эти прыгучие песики перемещаются и бегают.

Об охранных качествах чихуахуа тоже говорят: пусть этот пес и не волкодав, но о намерениях чужих вы узнаете сразу, благодаря заливистому лаю. Если посетители в доме неискренни, от собаки это не скроется, она просто не будет к ним подходить, да еще может облаять.

Вообще держать подобную собаку в доме – значит, постоянно ощущать мир и спокойствие, получать эстетическое наслаждение и радость. Чихуахуа готовы составить компанию в любом действии, они гуляют, сидят, смотрят телевизор и спят вместе с хозяином. При этом в поведении на руках их отличает удивительно спокойствие, с маленькими детьми пес тоже ладит отлично, если его не обижают. Часто чихуахуа покупают пожилым людям в роли компаньонов.

Чистоплотность – еще одна сильная черта характера чихуахуа. Их можно приучить к горшку и сделать диванными собачками, в любую погоду вы не услышите запаха. Но все-таки советуют сделать им прививки и хотя бы время от времени совершать длительные прогулки на свежем воздухе. Удовольствие получите и вы, и ваш маленький друг, особенно от общения с собаками других пород. Но будьте осторожны: в процессе игры крупные собаки могут просто навредить чихуахуа.

Чем кормить собаку чихуахуа

Взяв к себе щенка чихуахуа, вы должны сразу разузнать правильный рацион питания для вашего питомца. Есть два вида питания это: специальные корма для собак или же обычная пища. Самым простым конечно будет первый вариант.

Для маленьких щенков до трехнедельного возраста единственной пищей является грудное молоко матери. Из него они получают основной набор белков, жиров, углеводов, микроэлементов и витаминов. Лишь потом начинается прикормка горошинами из говяжьего мяса и творога. Их количество и размер постепенно увеличивается.

До двухмесячного возраста щенков следует кормить 6 раз в день. Затем количество кормлений постепенно уменьшается до 3 раз в день. Важно помнить, что из естественных кормов питательные вещества усваиваются собакой значительно легче, чем из искусственных. Лучший выбор – комбинированное кормление с использованием пищевых добавок.

Вкус у собаки формируется до 3-ех месяцев. В это период щенок запоминает вид и вкус разных продуктов. Важно, чем кормить щенков Чихуахуа, так как взрослая собака может отказаться от полезной пищи, если ее не давали щенку. Собаки этой породы часто капризничают и перебирают еду. В день им нужно съедать 50-80 грамм. Так что проще всего использовать натуральное кормление.

Чем кормить щенка чихуахуа? А ответ совсем прост это сухой и консервированный корм, который продается в магазинах для собак, содержат всё самое необходимое это витамины необходимые организму вашего питомца для отличного развития. В наше время на рынке представлено большое количество различных кормов, универсальных и ориентированных на конкретную породу. Чтобы подобрать правильный корм для вашей собаки вам нужно обратиться на консультацию к ветеринару.  Для здоровья питомца нужно выбирать только качественные корма суперпремиум или премиум класса, которые предназначены для декоративных собак. При этом у чихуахуа всегда должен быть доступ к питьевой воде.

Если вы все же приняли решение кормление щенков чихуахуа обычной пищей, необходимо знать, что нужно добавлять в пищу собаки витамины и микроэлементы. Так же нужно учесть, что не все продукты полезны и безопасны. Щенки чихуахуа никогда не будет, есть жирную, острую или соленую пищу. Овощи и фрукты будут очень полезны, и только в радость вашей собаке.

Важно помнить, что порода бывает привередливой и обжорливой. В рацион должна входить не только пища животного происхождения, но и вареные яйца, кисломолочные продукты, крупы и фрукты.

Мясо (говядину, курятину, телятину) лучше давать чихуахуа в отварном виде. Иногда можно предложить отварное филе рыбы морской без костей. А вот от минтая, речной рыбы, свинины, сладостей, баранины, макарон, мучных изделий, бобовых, капусты, колбасных изделий, сырой курицы, картофеля, белого хлеба, лука стоит отказаться. Противопоказаны чихуахуа кости.

Хоть родственник собаки – волк, но только мяса ей кушать не надо. В дневной рацион нужно включать творог, кисломолочные продукты. Можно давать овощи, ягоды и фрукты. Наиболее опасно для небольшой собаки – сладкое. Именно оно делает питомца капризным и грозит ему ожирением. Излишний вес может привести к тому, что у собаки остановится сердце, так как не сможет биться.

Чем кормить Чихуахуа, если предстоят частые путешествия? В этом случае можно приучить собаку кушать консервы и сухие корма. Их легко постоянно носить с собой вместе с собой. Собаке не нужен разнообразный рацион, главное – сбалансированность.

Живя с таким крохой, многие хозяева очень волнуются по поводу правильного кормления: казалось бы, чихуахуа много не надо, но и раскормить тоже никто не хотел бы. Ничего здесь необычного нет, у этих собак те же предпочтения в еде, что и у других пород. Кто-то кормит их сухими кормами, выбирая элитные марки, потому что действительно, много на такую собаку не тратится денег и еды. Подбирать корм нужно строго по весу и возрасту, а также исходя из особых состояний собаки. Например, беременность или кормление, старость или болезни.

Поскольку диета для маленького желудка чихуахуа все-таки имеет отличия, укажем распространенные ошибки, которые допускают хозяева:

О том, нужно ли кормить собаку со стола, вообще молчим: это «любимая» ошибка хозяев, превращающих чихуахуа в ручную игрушку. У собаки должно быть строго отведенное место для приема пищи. И главное, если надумаете менять корм, не приступайте к смене слишком резко, вводите новинку постепенно.

Болезни питомца

Общеизвестно, что болезнь лучше предотвратить, чем потом лечить. Внимание и ежедневный уход поможет сохранить здоровье питомцу. Чем же характеризуются болезни собак чихуахуа? Стоит побеспокоиться, если собака растет подавленной, вялой, недостаточно вынослива, перестает есть и пить, появляется диарея и рвота, собака царапает сама себя или трясет головой, теряет шерсть, появляются открытые раны на теле, на зубах возникает желтый зубной камень, появляется неприятный запах изо рта. У собаки может затрудниться дыхание, появиться чрезмерные выделения из носа или глаз. Питомец внезапно может стать агрессивным.

Если хоть один из этих признаков есть, нужно показать чихуахуа ветеринару. Зачастую болезни у собак вызывают внешние (клещи, вши, блохи) и внутренние паразиты. Гигиена и регулярных уход поможет контролировать присутствие внешних паразитов. Для борьбы с ними применяют также различные шампуни, спреи, лекарственные моющие средства.

Одно из самых страшных заболеваний – это бешенство у собак. Оно передается от укуса через слюну зараженного животного. Используйте профилактику – вакцинацию. Весьма серьезными являются парвовирус, чумка у собак, парагрипп и лептоспироз, но они не смертельны. Прививка и здесь будет лучшим способом защитить чихуахуа от них.

Уход за собакой чихуахуа

Ежедневный уход за маленькой собачкой особых трудностей не представляет. Небольшой собачке нужно уделять много внимания. Ее хрупкое телосложение требует бережного к себе отношения. Если вы задаетесь вопросом, как ухаживать за собакой чихуахуа, воспользуйтесь приведёнными советами:

Окрас чихуахуа

Окрас — это кинологический термин, который означает окраску шерсти собаки. Он является одним из самых важных признаков при селекции собак. Стандарт любой породы устанавливает допустимые и недопустимые окрасы. Собаки могут удивлять своей расцветкой. Для каждой породы собак характерен свой окрас и расцветка, поэтому, пытаться отыскать щенка нехарактерного окраса для данной породы – бессмысленное занятие.

Чихуахуа — это самая маленькая порода в мире, но с храбрым сердцем. Эти собаки любят быть только со своим хозяином и требуют минимального ухода и физических нагрузок. Различают две разновидности шерстного покрова чихуахуа: короткошерстную и длинношерстную.

Содержание

Когда человек выбирает домашнего питомца он дает предпочтение не только определенной породе, но также акцентирует своё внимание окрасу (в данном случае, выбирая щенка чихуахуа), она бывает разных оттенков и цветов, поражающих своими красивыми орнаментами и видами. Генетика — один из главных пунктов во внешности пса, именно от неё зависит окраска, вид шерсти и пропорции.

Что такое окрас и масть у собак чихуахуа

Видимый для окружающих пигмент внешней части волоса. Значительное количество собак наряду с пигментированным волосом имеет на отдельных местах тела, лишенных пигмента, белые пятна или отметины , т.е. волос, лишенный пигмента. При смешивании цветов, масть собаки определяют по доминирующему окрасу. У собаки бывают такие виды волос, как пуховой, покровный(гладкий), остевой. Различные свойства шерсти обусловлены как приспособление к различным климатическим условиям, к месту их обитания. За каждым типом шерсти и её окрасом нужен особый уход. Селекционерами было изучено как создаётся окрас и рисунок на теле животного. Гены могут отвечать за структуры волос и его окрас. Это общая информация, которая относится ко всем породам собак, а не к щенкам чихуахуа.

• А. С помощью этого локуса получается сплошная окраска всего тела питомца (однотонная).
• В. Красит шерсть в черный цвет. Некоторые виды обладают частичностью этого гена (пятнистостью). Некоторые породы собак имеют этот ген обязательно!
• С. Это ключевой компонент! С помощью него организм производит окрас всего покрова тела. Если не будет этого компонента, то собака может родиться без окраса (альбиносом). Окраска носа и радужной оболочки глаза не зависит от этого компонента.
• D. Если гена мало в организме питомца , то шёрстный покров будет светлее. Если гена много в организме, то собака будет иметь насыщенный чёрный цвет покрова. Ген влияет на жизнеспособность пса, если питомец родится с недостатком гена и голубым окрасом, то он может с большой вероятностью не дожить до своих старших лет. При доминировании гена окрас домашнего питомца получается чёрным.
• G. При старости этот компонент активизируется и появляется седина. Его называют седым. Когда окрас приобретает серый цвет.
• Е. С его помощью, в большинстве случаем получаются трёхцветные окрасы, располагая в себе пигмент черного, коричневого и желтого цветов.
• М. Ген приводит к аномалиям для питомца и даёт арлекинов рисунок. Имеет мраморный окрас. При старости ген может приводить к осветлению окраса.
• S. Этот ген вызывает у собаки частичную пигментацию тела. (белая пятнистость).
• T. Гену свойственна крапчатость. Он противоположен гену S и образует на белых участках тёмные пятна.
• R. Чалость — чередование волос, которые окрашены и нет.

Группы окрасов

Учёные разделили группы окрасов собак. Одноцветные окрасы относятся к первой категории ( они образуются с помощью пигментов эумеланина и феомеланина), а вторая подразделяется ещё на два подтипа: двухцветные ( сплошные окрасы с образованием белых или тёмных пятен) и многоцветные ( в этом случае у собаки пятна располагаются в строго определённых местах и имеют разные оттенки). Животные будут иметь окрас , который состоит из нескольких пигментов!

Окрас чихуахуа

ОКРАС: Любые окрасы и сочетания, за исключением мраморного.

Как правильно выбрать здорового щенка чихуахуа

При покупке щенка породы чихуахуа необходимо обратить свое внимание на физическое и психическое состояние щенка. Лучше всего перед приобретением изучить особенности породы. Не стоит покупать только потому что он очень сильно понравился. К примеру, спокойному и даже флегматичному человеку не подойдет малинуа — будут проблемы. Активному и спортивному человеку не подойдет сенбернар — будут проблемы. подбирайте себе собаку под ваш образ жизни и характер. Обратитесь за помощью к опытному кинологу, который сможет вам подобрать здорового щенка.

Родители щенка породы чихуахуа должны иметь родословные, допуск к разведению и тесты на здоровье, в каждой породе они свои. Разводные оценки и тесты — это не прихоть заводчиков, это гарантия того, что родители соответствуют описанию стандарта породы и здоровы.

Расспросите об аспектах ухода и кормления щенков (и их матери в период беременности), обработок в целях профилактики (дегельминтизация, вакцинация), о генетической составляющей (некоторые заболевания передаются с рождения, например: дисплазия тазобедренных суставов, которая может быть главной причиной дефектов конечностей). В случае, если мать щенков питается с общего стола – то это должно заставить вас задуматься. В период беременности и во время лактации, питание матери должно быть правильным, полноценным и сбалансированным. В данный момент соблюсти эти правила довольно просто, покупая сухой корм высокого качества. Как и человек, собаки склонны сильно болеть (проблемы с желудком, гастрит и тд.). Поэтому следует помнить, что: собаку выгоднее сразу хорошо кормить, чем потом лечить. Если изначально кормить своего питомца хорошим кормом, то и к ветеринару меньше ходить. Остатки еды с общего стола — не подходит для кормления собаки, скорей это прекрасный рацион для свиньи.

Очень рискованно покупать где-то на улице с рук или на рынке, выгода тут может быть только в цене. Высока вероятность, что вместо чихуахуа вам достанется дворняжка, к тому же больная. Лучшее место для покупки щенка — у заводчика дома, где можно увидеть его родителей, условия, в которых он содержится (это позволит сделать вывод о порядочности заводчика). Необходимо обратить внимание на чистоту самого дома, ведь это влияет на здоровья вашего будущего товарища. При покупке рекомендуем задать такие вопросы, как:

• Есть ли у родителей щенков родословная и каким клубом она выдана? Сейчас буквально все клубы считаются представителями Российской кинологической федерации, которая соответствует международному стандарту.
• Сколько месяцев щенкам?
• Сколько щенков в помете?
• Какова стоимость каждого щенка чихуахуа? Как правило, все заводчики, придерживаются определенной средней цены. Не пытайтесь найти дешевого, ведь если низкая цена и документы отсутствуют, это всегда подозрительно.

Тщательно осмотрите весь помет. Обращая внимание на то, как щенки проявляют активность, насколько они соответствуют породе и как они с вами взаимодействуют. Здоровый щенок чихуахуа должен быть веселый и любознательный, средней комплектации (не слишком толстый и не худой). Самое лучшее время для покупки щенка, когда ему будет 1,5-2,5 месяца. В этом возрасте щенки уже довольно самостоятельны, но все еще впечатлительны. Еще это хорошее время, чтобы определить привязанность между хозяевами и щенком, чтобы приступить к первому обучению. Щенок, который много проявляет агрессию, скорее всего, останется таким же агрессивным, как и взрослая собака; если сильно застенчив, вероятней всего, так и останется робким. Постарайтесь как можно больше времени провести с щенками. Это может дать вам возможность многое понять и увидеть. Как щенки реагируют на незнакомцев, как они играются между собой, возможность понять кто является лидером. Порядочный заводчик не должен настаивать на быстром выборе щенка. Определить характер питомца можно еще до его покупки, по его кормлению и социализации.

Хорошо осмотрите щенка чихуахуа. Если слизистая ярко-розового цвета, значит всё в порядке; если она бледного цвета, могут быть проблемы с глистами или анемией. Состояние зубов у щенка? Прикус должен быть в соответствии со стандартом у такой породы. Глаза должны быть, без покраснений, воспалений и без гнойных выделений. Грязные уши, а также постоянное покачивание головой может указывать на инфекцию уха или наличие клещей, поэтому ушки должны быть чистыми и не должны пахнуть.

Живот у щенка чихуахуа должен быть не раздутый при правильном кормлении. Вздутие в пупке или паху указывает на грыжу. В мошонке должны находиться оба яичка. Шерстка должна быть ухоженная и блестящая. Если имеются раны или расчесы на коже, то это может означать наличие: блох, клещей или аллергии.

Необходимо проверить физическое состояние щенка чихуахуа, какой у него костяк, хорошо ли сформированы конечности, как работают пальцы. Также следует обратить внимание кондицию, походка должна быть ровной. Также не следует брать слишком худого или слишком откормленного.

Щенок чихуахуа должен быть не трусливым. Определить смелость щенка можно: хлопнув у него над головой в ладоши или погремите ключами. Трусливые щенки испугаются и прижмутся к полу, а смелые заинтересуются звуком. Протяните руку к щенкам — самый смелый подойдет к вам: если, один из щенков выберет именно вас, значит вы ему понравились.

Когда вы осмотрели щенка чихуахуа, смогли определиться с выбором, перейдите к осмотру документации, которую заводчик должен вам предоставить. Самое главное наличие, ветеринарного паспорта. В котором будет информация о вакцинации и о проведенной дегельминтизации. У щенка, должна быть минимум одна прививка. А также нужно спросить у заводчика график дальнейшей вакцинации. В документы породистого щенка должна входить метрика (свидетельство о рождении). Номер клейма в метрике должен совпадать с клеймом у щенка (как правило ставится в паху). Внимательно ознакомьтесь с договором купли-продажи. Договор гарантирует, что, если щенок окажется не здоров – то его можно вернуть обратно заводчику.

Перед покупкой щенка чихуахуа необходимо внимательно осмотреть его на предмет визуальных признаков наличия патологий, узнать о здоровье его родителей и однопометников.

В дальнейшем важно регулярно посещать ветеринара для планового осмотра питомца – это поможет обнаружить болезнь на ранней стадии и как можно раньше начать лечение.

Хрипы и взламывания чихуахуа

Вы замечали, что ваш чихуахуа хрипит, задыхается или издает похожие хрипящие звуки? Многие владельцы автоматически предполагают худшее, когда их чихуахуа начинает испытывать один из этих эпизодов, и в результате они могут поспешно бросить их к ближайшему ветеринару скорой помощи, где они накапливают счета на сумму, превышающую 1000 долларов. Однако факт в том, что свистящее дыхание (AKA обратное чихание ) является слишком частым явлением у породы чихуахуа.

Даже если ваш чихуахуа еще не испытал ни одного из этих эпизодов, все равно важно просвещать и знакомиться с этим заболеванием, поскольку это одна из наиболее распространенных проблем со здоровьем, связанных с этой породой. Как их владелец, вы обязаны знать, как лечить любые проблемы со здоровьем, которые могут возникнуть у вашего чихуахуа, и обратное чихание является одним из этих условий. Только тогда вы можете быть уверены, зная, что у вас есть возможность обеспечить безопасность и комфорт вашего чихуахуа, когда они начнут хрипеть.

Обратное чихание / свистящее дыхание — признаки, на которые следует обратить внимание

Большинству владельцев довольно легко определить эпизоды обратного чихания / свистящего дыхания у их чихуахуа. Хотя некоторые чихуахуа могут демонстрировать немного иное поведение во время эпизода, большинство из них прекращают свои действия, наклоняют голову вниз и начинают рубить, задыхаться и хрипеть, как будто они изо всех сил пытаются дышать. К счастью, чихуахуа все еще могут дышать во время этого процесса, поэтому это может показаться более пугающим, чем то, что есть на самом деле.Некоторые владельцы сравнивают это с кошкой, пытающейся взломать комок из волос, только после того, как ваш чихуахуа закончил рубить, ничего не выходит физически.

Наблюдать, как ваш чихуахуа задыхается, будто не в силах дышать, — пугающее испытание для любого владельца. Некоторые владельцы, которые никогда не видели этих эпизодов свистящего дыхания, могут отчаянно пытаться очистить дыхательные пути своего чихуахуа, что создает только больший дискомфорт. Другие могут бросить своего чихуахуа к ветеринару, думая, что уже под рукой что-то более серьезное.В результате этим владельцам остаются дорогие ветеринарные счета и нет реального лечения проблемы. На самом деле обратное чихание / свистящее дыхание — обычное явление для породы чихуахуа, и они звучат намного хуже, чем есть на самом деле.

Причины обратного чихания / хрипов

Чтобы понять, что вызывает эти эпизоды обратного чихания / свистящего дыхания у чихуахуа, вы должны сначала осмотреть место, где это происходит. Хотя название предполагает, что это связано с чиханием, на самом деле это вызвано раздражением мягкого неба в области неба.Если вы сможете увидеть внутреннюю часть рта чихуахуа, вы заметите твердое небо, которое расположено у нёба, а мягкое нёбо простирается в стороны. Считается, что эпизод обратного чихания / свистящего дыхания вызван раздражением или смещением мягкого неба, что также известно как спазм глотки.

Распространенные причины обратного чихания / хрипа:

• Слишком много пить или есть слишком быстро.
• Чрезмерно возбужден от игр, угощений или чего-то еще.
• Аллергические реакции или повышенная чувствительность к пыли, пыльце или другим загрязнителям воздуха.
• Натягивание поводка при плотном ошейнике.
• Использование агрессивных химикатов в доме может вызвать у вашего чихуахуа приступ.
• Полипы (мешки с кровью), расположенные в горле и рту или вокруг них.
• Заражение носовыми клещами.
• Деформации роста, например чрезмерное количество мягких тканей неба.

Хотя некоторые владельцы могут определить основную причину эпизодов обратного чихания / хрипа их чихуахуа, в большинстве случаев заметной причины нет.Рекомендуется попытаться определить, вызывает ли какая-либо из перечисленных выше причин приступ чихуахуа, и если да, то вам следует попытаться устранить проблему.

Как лечить обратное чихание / хрипы Эпизод

К сожалению, нет известного лекарства от эпизодов обратного чихания / хрипа у чихуахуа и других маленьких собак. Отправление их к ветеринару обычно заканчивается пустой тратой денег, поскольку приступ вашего чихуахуа, скорее всего, пройдет сам по себе, задолго до того, как вы даже доберетесь до ветеринара.С учетом сказанного, есть несколько вещей, которые владельцы могут сделать, чтобы успокоить и утешить вашего чихуахуа, когда он хрипит.

Когда вы видите, что ваш чихуахуа задыхается во время эпизода, встаньте на пол и нежно помассируйте его шею рукой. Просто положите руку ему на шею и потрите ее по часовой стрелке. Если вы не прикладываете слишком много усилий, легкий массаж сократит продолжительность спазма. Кроме того, некоторые владельцы обнаружили, что зажимание ноздрей своего чихуахуа также помогает сократить эпизоды.Логика этого заключается в том, что чихуахуа заставляют дышать ртом, когда их ноздри закрыты; следовательно, это нормализует их дыхательный цикл.

Некоторые ветеринары могут также порекомендовать дать вашему чихуахуа Бенадрил или другие лекарства, отпускаемые без рецепта, если они считают, что причиной их приступов является аллергия. Прежде чем давать чихуахуа ЛЮБОЕ лекарство, поговорите со своим ветеринаром, чтобы убедиться, что это безопасно.

Видео чихуахуа, чихание в обратном направлении

Посмотрите видео выше, чтобы точно продемонстрировать, как выглядит эпизод обратного чихания / свистящего дыхания у чихуахуа.Как видите, чихуахуа останавливается и начинает кашлять и хрипеть, как будто им хватает ртом воздух. Если вы не знаете иначе, можно было бы предположить, что чихуахуа задыхается, но, к счастью, это не так. Большинство чихуахуа начинают дышать и снова начинают вести себя нормально через 15-30 секунд.

Артикул:

Обратное чихание собак Википедия

PetMD Обратное чихание

Facebook

Twitter

Google+

Pinterest

Электронная почта

Chia Hua Chen MMA Статистика, изображения, новости, видео, биография

Побед 0 0 нокаутом / техническим нокаутом ( 0% ) 0 ПРЕДСТАВЛЕНИЙ ( 0% ) 0 РЕШЕНИЙ ( 0% )

Убытки 0 0 нокаутом / техническим нокаутом ( 0% ) 0 ПРЕДСТАВЛЕНИЙ ( 0% ) 0 РЕШЕНИЙ ( 0% )

Персонализированная упряжь для собак без вытягивания

Больше никаких вытягиваний и блокировок! Измените свой старый ошейник сегодня на шлейку No Pull Dog Harness!

Это может спасти шею вашей собаке!

Если ваш щенок носит только обычный собачий ошейник, он может сильно напрячь горло при натяжении вперед, особенно если вы возьмете поводок или дернете его назад.

Такое давление может повредить шею вашей собаки независимо от ее размера, но особенно если она принадлежит к более мелкой породе.

Наши хомуты для ремней безопасности, не тянущие и препятствующие удушению — правильный выбор!

Почему более 1500+ родителей любят нашу шлейку:

✔️ Персонализируйте шлейку , указав имя и номер телефона вашей собаки

✔️No Pull — Обучает собаку ходить рядом с вами

✔️Прочная пряжка: Боковая пряжка прочная и устойчивая к взлому, ее очень удобно расстегнуть.

✔️Регулируемые ремни: Шейный и нагрудный ремни регулируются, это не даст собаке чувства стеснения и беспокойства.

✔️ Светоотражающие ремни обеспечат безопасность вашей собаки в ночное время.

✔️ D-образное кольцо из нержавеющей стали позволяет прикрепить веревку, привязанную, когда вы ведете машину, вы можете привязать ее к сиденью.

✔️Легко — включено, легко — выключено! 5 секунд, чтобы надеть или снять.

✔️Комфортность: Тканевый материал устойчив к разрывам, а ремни не обладают эластичностью, поэтому не деформируются.Мягкая губка не повредит кожу щенков. Дышащий и легкий, чтобы сделать ваш меховой мяч более комфортным.

✔️100% гарантия: Мы стремимся предоставить вам продукцию высокого качества и сделать покупки максимально комфортными. Присоединяйтесь к нашим более чем 1500 клиентам, которым нравится наша персонализированная шлейка для домашних животных.

✔️Доставка со склада в США

Таблица размеров:

Размер	Вес (фунты)	Вес (кг)
XS	6-16 фунтов	3-7.5 кг
S	16-33 фунтов	7-15 кг
м	29-48 фунтов	13-22 кг
л	44-77 фунтов	20-35 кг
XL	77-100 фунтов	35-45 кг
XXL	88-155 фунтов	40-70 кг

ДАННЫЙ ПРОДУКТ ЯВЛЯЕТСЯ ОГРАНИЧЕННЫМ ПРОИЗВОДСТВОМ И НЕДОСТУПЕН В МАГАЗИНАХ.ПРОДАЕТСЯ БЫСТРО!

Нажмите ДОБАВИТЬ В КОРЗИНУ , чтобы заказать прямо сейчас!

НАША ГАРАНТИЯ

Если у вас нет положительных впечатлений от покупок в petkitshop , мы сделаем все возможное, чтобы вы были на 110% довольны своей покупкой.

Покупки в Интернете иногда могут быть непростой задачей, поэтому мы хотим, чтобы вы знали, что при покупке чего-либо в petkitshop и его опробовании абсолютно нулевой риск.Если тебе это не нравится, без обид, мы все исправим.

Мы стремимся быть поставщиком №1, предлагающим вам самый лучший опыт покупок в Интернете. Мы на 110% стремимся к тому, чтобы вы были полностью удовлетворены. 🙂

WE. УХОД.

У нас есть круглосуточная поддержка по тикетам и электронной почте 24/7/365. Пожалуйста, свяжитесь с нами, если вам понадобится помощь. Мы здесь ради тебя!

Обработка заказов

Примечание. Для заказов с несколькими товарами время обработки будет зависеть от товара с более длительным временем обработки.
Если не указано иное, все заказы покидают наш склад в течение 2–4 рабочих дней. После того, как товар покидает фабрику, получение товара обычно занимает от 10 до 20 рабочих дней, в зависимости от вашего альтернативного местоположения. После отправки товара вы сразу получите номер для отслеживания от транспортной компании. Так вы узнаете, где находятся товары и сколько времени на это потребуется.
Обратите внимание, что время доставки не включает время обработки. Общее время, необходимое для получения заказа, составляет время обработки + время доставки.
Если с вашим заказом возникнут какие-либо проблемы, вы можете отправить запрос о неисправности в наш центр поддержки для получения дополнительной помощи. Наша специализированная служба поддержки свяжется с вами в течение 24 часов.
По сравнению с небольшими посылками, доставляемыми FedEx или UPS, транспортировка крупных предметов занимает больше времени. Сотрудничаем с крупными экспедиторами.

Транспортировка и транспортировка

Беспошлинная торговля, стандартная доставка — 5,98 долларов США (весь мир)
Без учета налогов, бесплатная доставка при заказе от 49.99 долларов США (применимо к разовым заказам по всему миру)

В petkitshop для нас большая честь приносить нашим клиентам большую ценность и обслуживание. Мы предоставляем услуги доставки со складов в США и Китае через FedEx, USPS, DHL, 4px и другими экспресс-методами.

Caveat
Фактически, мы гарантируем своевременную доставку 95% заказов. Для некоторых удаленных мест это может занять больше времени.
Для всех посылок есть специальная информация для отслеживания.

Способ доставки и стоимость

Примечание:

В праздничные дни (с понедельника по пятницу рабочие дни) время доставки может быть изменено, поскольку производители и курьерские компании будут ограничивать операции в этот период.Хотя, к сожалению, это вне нашего контроля, мы сделаем все возможное, чтобы решить эту проблему.

Предоставляете ли вы информацию для отслеживания?

Да, вы получите электронное письмо с информацией для отслеживания после отправки вашего заказа. Если вы все еще не получили информацию об отслеживании в течение 5 дней, свяжитесь с нами.
В моей записи отслеживания указано: «В настоящее время нет информации».
Если информация об отслеживании недоступна, повторите попытку позже. Будьте уверены, что расчетное время доставки действительно независимо от статуса обновления веб-сайта отслеживания.
https://www.17track.net/cn

Налоги и сборы

Для США
Обратите внимание, что наши продукты не облагаются налогами в США.
* Все сроки доставки не включают таможенное оформление / таможенные задержки. Мы не несем ответственности за любые другие таможенные пошлины, которые могут потребоваться для оплаты заказов за пределами США.
Спасибо за доверие к нашему бизнесу! Если у вас есть вопросы, обратитесь в наш центр обслуживания клиентов: service @ petkitshop.com за помощью с вашим заказом.

активистов говорят о немых собаках

ТАЙБЕЙ, Тайвань —

Глаза Пипи яростно выпучиваются, когда незнакомцы подходят к чихуахуа в тесном магазине одежды, где работает ее хозяйка.

Но Пипи не лает. Она никогда не лает. Она никогда этого не сделает.

Ее владелец, Чэнь Шэн-хуа, подозревает, что у спасенного бродяги были перерезаны голосовые связки.

«Когда она открывает рот, ничего не выходит», — сказал Чен.

Активисты по защите прав животных говорят, что часто находят немых собак, которые, по всей видимости, были брошены нелегальными заводчиками, которые испытывают проблемы с продажей животных в условиях медленной экономики Тайваня.

В таком многолюдном месте, как это, где большинство людей живет в квартирах или густонаселенных городах, нелицензированные заводчики склонны перерезать голосовые связки собак, чтобы они не беспокоили других и не привлекали внимание властей, говорят активисты.

«Проблема собаки-немого похожа на проблему бездомных животных, являющаяся результатом неправильной политики», — сказал активист Шэнь Чжун-чен.

Группы по защите прав животных говорят, что власти слишком долго ждали, прежде чем предпринять шаги, направленные на сдерживание значительного роста числа бездомных собак, такие как стерилизация и регистрация животных.

Активисты также критиковали людей за то, что они покупают симпатичных маленьких собачек, а затем бросают их, когда они вырастают или стареют.

Ветеринар Чен Чиа-чун говорит, что собаки крайне редко рождаются немыми. Он подозревает, что Пипи потеряла голосовые связки в результате новой хирургической операции, которая не оставила шрамов.

«Раньше операции по удалению голосовых связок собаки оставляли след на внешней стороне горла животного», — сказал он. «Но теперь ветеринары входят прямо в горло через рот и удаляют голосовые связки изнутри.

Чен говорит, что однажды по телефону его попросили выполнить такую ​​операцию, но он отказался.

Ветеринар говорит, что это не всегда заводчики. Иногда люди подбирают бродячих особей, но тогда соседи жалуются на шум, оставляя новым владельцам выбор: либо снова выбросить собаку на улице, либо заставить ее замолчать.

Однако Шен, борец за права животных, утверждает, что почти во всех случаях ответственность несут частные заводчики, а не традиционные владельцы домашних животных.

Люди начинают разводить собак дома с целью получения прибыли, — говорит Шен.Но поскольку они опасаются, что соседи пожалуются в полицию, заводчики перерезают голосовые связки животных. «Если незаконные заводчики думают, что поимка близка, они выбрасывают животных на улицу», — говорит Шен.

«Только около 30 из 300 частных собаководов зарегистрированы», — сказала Шен, добавив, что продвижение их обязательной регистрации является одним из приоритетов ее группы.

В изолированной долине к югу от Тайбэя воздух густой от запаха фекалий, производимого примерно 850 собаками, живущими в приюте, управляемом добровольцами.Ряды клеток, некоторые прикрыты гофрированной металлической крышей.

В каждой клетке живут пары грязных собак, и большинство из них начинают лаять, как только видят посетителей. К чистокровным подмешивают дворняг.

Одна волонтер, Ян Сян, говорит, что из 500 собак, за которых она отвечает, более десятка являются немыми, в том числе четыре, взятые вместе. Их могло быть и больше, но найти их сложно, потому что они заглушены оглушительным лаем сотен собак.

Одна из немых — Нана, пастушья смесь с длинными ушами и длинным пушистым хвостом. Ей удается издать звук, но это всего лишь хриплое кваканье, а не лай или визг большой здоровой собаки.

Ян беспокоится о собаках, потому что их число продолжает расти, а пожертвования сокращаются. Многие тайваньцы не хотят усыплять собак, потому что это нарушает их буддийские верования.

«Люди, которые приводят собак, также несут ответственность за оплату еды», — сказала она.«Но поскольку экономика Тайваня пришла в упадок, пожертвования сокращаются».

Wu Research Group

# Newblood (где ты сказал?)
(лето 2021 г.).

#to togethermode
(весна 2021 г.).

# радуги
(лето, 2020).

— Наденьте маску —
(Лето, 2020).

Пять месяцев спустя … Прощание с Хари и Джовой
(лето 2020 г.).

День раньше, чем все остались дома …
(Весна, 2020).

Поход 13 км завершен пиццей и пивом …
(Весна, 2020).

Тренировка после праздника
(осень, 2019 г.).

Двойной праздник!
(осень, 2019 г.).

Двойной праздник!
(осень, 2019 г.).

HBOND2019 в Амстердаме, Нидерланды
(осень, 2019 г.).

Baird-fest в Сигтуне, Швеция
(лето 2019 г.).

Baird-fest в Сигтуне, Швеция
(лето 2019 г.).

Групповое изображение
(осень, 2018 г.).

Aromaticity18, Ривьера Майя, Мексика.
(осень 2018 г.).

Химики разбираются с финансами…
Групповая рождественская вечеринка (2018).

Групповая новогодняя вечеринка
(Зима, 2018).

Большой сюрприз Чжили …
Групповая рождественская вечеринка (Зима, 2018).

Чиа-Хуа выигрывает приз плаката PCCP!
ESCB2, Овьедо, Испания (осень 2018 г.).

Семинар-доклад в UCLA
(осень 2018 г.).

Групповой обед
(весна 2018 г.).

Сидр и много (… и много) мяса
ESCB2, Овейдо, Испания (2018).

Первая групповая рождественская вечеринка
(осень, 2016).

Оценка биохимических изменений во время старения эритроцитов in vivo у собак | Кровь

Одна из гипотез, объясняющая возрастной клиренс эритроцитов (эритроцитов) из кровообращения, предполагает, что денатурированный / окисленный гемоглобин (гемихромы), возникающий поздно в течение жизни эритроцитов, вызывает кластеризацию интегрального мембранного белка, полоса 3.В свою очередь, кластеризация полосы 3 генерирует эпитоп на поверхности стареющих клеток, что приводит к связыванию аутологичных IgG и последующему фагоцитозу. Поскольку эритроциты собак обладают характеристиками выживаемости, которые очень похожи на характеристики эритроцитов человека (т. Е. Низкая случайная потеря эритроцитов, продолжительность жизни ≈115 дней), мы решили проверить несколько аспектов вышеупомянутой гипотезы на собачьей модели, где клетки старшего возраста in vivo определенный возраст может быть оценен на предмет биохимических изменений. С этой целью эритроциты собак были биотинилированы in vivo и извлечены для биохимического анализа в различные более поздние сроки с использованием покрытых авидином магнитных шариков.В соответствии с вышеприведенной гипотезой, было обнаружено, что стареющие эритроциты собак содержат заметно повышенный мембраносвязанный (денатурированный) глобин и семикратное увеличение ассоциированного с поверхностью аутологичного IgG. Интересно, что эритроциты собак, которым позволяли стареть в течение 115 дней in vivo, также страдали от сниженной внутриклеточной восстанавливающей способности, так как они содержали только 30% восстановленного глутатиона, обнаруженного в нефракционированных клетках. Хотя небольшое количество клеток возрастом ≥110 дней не позволяло проводить прямое количественное определение кластеризации полосы 3, тем не менее было возможно использовать методы микродеформации отдельных клеток для оценки доли молекул полосы 3, которые утратили свои нормальные скелетные связи и были свободными. группироваться в ответ на связывание гемихрома.Важно отметить, что полоса 3 в эритроцитах возрастом ≥112 дней оказалась на 25% меньше сдерживаемой скелетными взаимодействиями, чем полоса 3 в контрольных клетках, что указывает на то, что нормальные связи между полосой 3 и скелетом мембраны были существенно нарушены. Интересно, что соотношение белок 4.1a / белок 4.1b, которое обычно считается отражающим возраст эритроцитов, оказалось максимальным в эритроцитах, выделенных только через 58 дней после мечения, что означает, что, хотя этот маркер полезен для идентификации очень молодых популяций эритроцитов, он является не очень чувствительный маркер для стареющих эритроцитов собак.Взятые вместе, эти данные свидетельствуют о том, что некоторые из легко проверяемых элементов вышеупомянутой гипотезы, предполагающей участие полосы 3 в старении эритроцитов человека, могут быть подтверждены на соответствующей модели собак.

H UMAN эритроциты (эритроциты) имеют циркулирующую продолжительность жизни ≈120 дней, после чего они распознаются и удаляются из кровотока макрофагами системы мононуклеарных фагоцитов. клетки были предприняты многими, 2 прогрессу препятствовало отсутствие модельной системы, которая позволяет изолировать действительно стареющие клетки после их старения in vivo.2 Хотя методы разделения в градиенте плотности позволили собрать человеческие эритроциты, предназначенные для немедленного удаления, 3 все еще существуют опасения, что самые плотные клетки могут не быть действительно стареющими. от живых животных успешно сгенерировал много информации об изменениях, которые происходят во время старения эритроцитов, 4-7,9-17, но эти исследования могут не иметь отношения к эритроцитам человека, поскольку в них использовались животные (кролики, грызуны), которые демонстрируют высокий случайный (не зависящий от возраста) ) Удаление эритроцитов и короткая продолжительность жизни эритроцитов (от 50 до 70 дней).18,19 Чтобы обойти эту проблему, мы адаптировали метод биотинилирования для применения на собаках, 20 в основном потому, что характеристики выживаемости эритроцитов у собак очень похожи на эритроциты человека в том, что они демонстрируют низкое случайное удаление18 и длительную продолжительность жизни ≈115 дней.18, 21,22

Поскольку зрелые эритроциты неспособны синтезировать новые белки, события, запускающие удаление стареющих клеток из кровообращения, должны происходить из-за изменений в уже существующих белках или липидах, которые приводят к распознаваемым изменениям на поверхности мембраны.Мы и другие предположили, что одним из таких изменений является зависящая от возраста кластеризация трансмембранного белка, полоса 3.23-29. Согласно этой гипотезе, кластеризация полосы 3 может возникать из-за множества механизмов, которые активны на поздних этапах жизни эритроцитов, включая денатурация гемоглобина (Hb) 23,25 и окисление белков. 26,27,30 При образовании кластеров 3-го диапазона имеются значительные доказательства обязательной опсонизации кластеров аутологичными антителами24,26,27,31-34 Доказательства на сегодняшний день предполагает, что эти аутологичные антитела против полосы 3 состоят преимущественно из подкласса 2 и 3 IgG.31 Однако точное определение антигена на полосе 3 является спорным, поскольку сообщалось об эпитопах углеводов26,35 и белков36 на переносчике анионов. Кроме того, антитела против полосы 3 способны связывать компонент комплемента C337 и образовывать комплексы C3b-IgG.38 Эти комплексы C3b-IgG могут образовывать ядро ​​конвертазы C3 альтернативного пути комплемента, что приводит к отложению дополнительных компонентов комплемента на поверхности стареющих клеток39. В конце концов, эритроциты покрываются достаточным количеством антител и комплемента для распознавания и удаления из кровотока макрофагами системы мононуклеарных фагоцитов.1,2,24,27,40

Обсуждаемый выше путь удаления эритроцитов в первую очередь охарактеризован путем изучения патологических (серповидных и талассемических), разделенных по плотности 32,34, 33,38 или модифицированных in vitro эритроцитов.24,26,27 Однако очень мало доказательств, подтверждающих этот путь. был получен из нормальных стареющих in vivo эритроцитов, которые, несомненно, стареют и имеют характеристики выживания, аналогичные человеческим. Наши предварительные исследования с использованием системы биотинилирования на собаках показали, что эритроциты собак старше 104 дней связывают значительно больше аутологичных IgG, чем эритроциты собак случайного возраста.41 В этом отчете мы рассмотрели несколько дополнительных прогнозов гипотезы кластеризации старения эритроцитов у собак.

Две собаки (№№ 1630 и 5005), использованные в этих исследованиях, были здоровыми половозрелыми самцами гончих, полученных от коммерческого поставщика случайного источника. Они были размещены в помещении и содержались в соответствии с правилами Комитета по уходу и использованию животных Университета Пердью. Обе собаки считались здоровыми, что определялось гематологическим и клиническим биохимическим профилями, а также тестами на паразитов (кишечник, кровь).

Для получения большей популяции биотинилированных эритроцитов для сбора в конце периода жизни эритроцитов биотинилирование выполняли во время ретикулоцитоза в ответ на ятрогенную анемию кровопотери. Собака нет. У 5005 брали кровь три раза в течение 3-дневного периода, снижая гематокрит (Hct) до 30% (Hct перед кровотечением, 49%), и биотинилирование выполняли через 7 дней после первого кровотечения. Собака нет. 1630 брали кровь три раза в течение 4-дневного периода, снижая Hct до 33% (Hct перед кровотечением, 50%), и биотинилирование выполняли через 13 дней после первого кровотечения.

Обе собаки имели от 97% до 100% циркулирующих эритроцитов, биотинилированных внутривенной (IV) инфузией N-гидроксисукцинимид биотина (NHS-биотин; Fluka, Milwaukee, WI), растворенного в диметилсульфоксиде, как описано ранее.20 Вкратце, NHS-биотин растворяли в 90% диметилсульфоксиде медицинского качества (DMSO; Syntex, West Des Moines, IA) и вводили очень медленно через постоянный (IV) катетер. Обе собаки первоначально получали 35 мг NHS-биотина на кг массы тела в течение примерно 30 минут.Однако из-за низкой концентрации биотина в эритроцитах для собак нет. 5005, дополнительные 17 мг NHS-биотина на кг массы тела вводили через 4 дня после начального биотинилирования. Предварительная обработка обеих собак сульфатом атропина (0,05 мг / кг) использовалась для противодействия холинергическим побочным эффектам ДМСО.

Подробные процедуры выделения состаренных in vivo биотинилированных эритроцитов с помощью сортировки клеток, активируемых магнитными шариками (MACS), были описаны в другом месте.20 Вкратце, гепаринизированную цельную кровь трижды промывали холодным PBS-G (125 ммоль / л хлорида натрия, 20 ммоль / л фосфата натрия, pH 7,4, 5 ммоль / л EDTA, 0,01% азида натрия, 5 ммоль / л глюкозы). , удаляя лейкоцит и белки плазмы. Процент биотинилированных эритроцитов в кровотоке определяли путем инкубации аликвоты эритроцитов (2% Hct) с авидин-флуоресцеина изотиоцианатом (авидин-FITC) (0,033 мг / мл; Sigma, Сент-Луис, Миссури, или Becton Dickinson, Сан-Хосе, США). CA) при 37 ° C в течение 30 минут. Затем эритроциты трижды промывали PBS-G и ресуспендировали в растворе BSA (1% бычий сывороточный альбумин в PBS-G) для анализа с использованием проточного цитометра серии Coulter Epic Elite (Coulter, Hialeah, FL).Биотинилированные клетки в промытых нефракционированных образцах метили для сортировки путем инкубации с авидин-FITC в PBS-G в течение 10 минут на льду (0,188 мг авидин-FITC на 0,150 мл упакованных биотинилированных эритроцитов). Клетки дважды промывали PBS-G с последующей 5-минутной инкубацией на льду с биотинилированными микрогранулами MACS (0,0676 мл микрогранул на 0,150 мл упакованных биотинилированных эритроцитов; Miltenyi Biotec, Auburn, CA). Помимо того, что он служит перекрестным линкером, авидин-FITC служил внутренним флуоресцентным маркером для оценки эффективности очистки.

Для сортировки эритроциты разбавляли до 2% гематокрита в растворе BSA, наносили на разделительную колонку MACS (размер «D» от Miltenyi Biotec), содержащую стальную вату с пластиковым покрытием, и помещали в магнитное поле постоянного магнита (обеспечивая ≈ 0,6 Тл; получено на месте). Биотинилированные эритроциты (положительная фракция), приставшие к стальной вате, и немеченые эритроциты (отрицательная фракция) элюировали раствором BSA. Неизвлеченные эритроциты разбавляли до 1% Hct раствором BSA, повторно наносили на колонку в присутствии магнита и элюировали раствором BSA.Затем колонку тщательно промывали раствором BSA, снимали с магнита и смывали с колонки биотинилированные эритроциты.

призрачных мембран эритроцитов получали из изолированных клеток путем гипотонического лизиса в 5 ммоль / л фосфата натрия, 1 ммоль / л EDTA, pH 8,0 в присутствии 40 мкг / мл фенилметилсульфонилфторида (буфер для лизиса) по методике Dodge et al. al.43 Лизат центрифугировали при 12000 g в течение 40 минут и супернатант удаляли.Осадки мембран ресуспендировали и трижды промывали в буфере для лизиса. Содержание белка в мембранах определяли методом бицинхониновой кислоты (BCA; Pierce, Rockford, IL), и мембраны солюбилизировали в буфере для электрофореза SDS, содержащем 100 ммоль / л дитиотреитола, и нагревали в течение 3 минут на кипящей водяной бане. Для собаки нет. 5005, аликвоту каждого образца мембраны хранили в течение ночи при 4 ° C для анализа с помощью гель-электрофореза на следующий день. Остальных призрачных перепонок у собаки нет.5005 и все мембраны собаки № 1630 хранили при -80 ° C до завершения окончательного выделения. Призрачные мембраны разделяли на полиакриламидных гелях с градиентом от 6% до 12% и либо окрашивали на белок кумасси бриллиантовым синим (Sigma), либо переносили на нитроцеллюлозу (размер пор 0,2 мкм; Schleicher and Schuell, Keene, NH) с использованием буферной системы Towbin et al44 и блокировали 5% молоком в TBS-T (20 ммоль / л Трис, pH 7,5, 500 ммоль / л NaCl, 0,05% Твин 20). Для проявления иммуноблот промывали TBS-T и инкубировали при комнатной температуре в течение 3 часов в растворе кроличьего антитела против собачьего Hb (Research Plus, Байон, Нью-Джерси), разведенном 1/5000 в TBS-T с 1% молоком.После дополнительной промывки и инкубации с меченными пероксидазой козьими антителами против кроличьих IgG (Bio-Rad, Hercules, CA) иммуноблоты проявляли с использованием набора реагентов повышенной хемилюминесценции (ECL) (Amersham, Arlington Heights, IL) с последующим экспонированием на пленке. . Чтобы определить, изменились ли картины полос в SDS-полиакриламидных гелях наших призрачных мембран во время хранения при -80 ° C, аликвота каждого образца от собаки № 5005 разрешился на следующий день сразу после приготовления. Мы не обнаружили заметных различий между образцами полос в образцах, проанализированных сразу после приготовления, и образцах, хранящихся при -80 ° C (результаты не показаны).

Хотя гипотеза кластеризации полосы 3 клиренса стареющих эритроцитов предсказывает, что фагоцитоз стареющих клеток запускается связыванием антител с индуцированными гемихромом агрегатами полосы 3, мало усилий было направлено на определение причины образования гемихрома из окисленного / денатурированного гемоглобина на поздних стадиях. термин эритроциты. Полагая, что этот последний процесс может происходить из-за неспособности поддерживать адекватную восстанавливающую способность в клетке, 2,25,26 мы исследовали сниженное содержание GSH в эритроцитах собак в возрасте in vivo как функцию возраста клетки.Уровни клеточного GSH определяли в контрольных (предварительных и отрицательных) и положительных (биотинилированных) фракциях эритроцитов, выделенных от собаки № 16:30 в 3 отдельных дня ближе к концу продолжительности жизни биотинилированных эритроцитов. Как показано на рисунке 1, нефракционированные эритроциты (сплошные точки), эритроциты, не полученные с помощью шариков, покрытых авидином на 108 день (возраст <108 дней, белые кружки), и биотинилированные эритроциты, собранные в тот же день (возраст ≥108 дней, сплошные треугольники) все клетки содержали от 10 до 12 мкмоль GSH / г Hb в своих клетках. Однако в течение следующих 7 дней, когда биотинилированные клетки достигли возраста не менее 115 дней, содержание в них GSH снизилось до 1/3 от их значения неделей ранее, в то время как не извлеченные клетки (возраст <115 дней), а также нефракционированные клетки сохраняли высокое (≈12 мкмоль / г Hb) содержание GSH.Эти данные предполагают, что резкое изменение внутриклеточной восстанавливающей способности происходит ближе к концу периода жизни эритроцитов. Хотя ограниченное количество биотинилированных клеток с поздним сроком хранения не позволяло собирать данные от нескольких собак, наблюдение, что ни нефракционированные эритроциты, ни фракционированные эритроциты, которые не смогли связать гранулы (более молодые клетки) от одной и той же собаки, не показали какого-либо снижения клеточных уровней GSH, предполагает, что изменения, наблюдаемые в биотинилированных клетках, реальны. Однако вопрос о том, окажется ли такое поведение признаком старения эритроцитов у всех собак, очевидно, потребует дальнейшего изучения.

Рис. 1.

Внутриклеточные восстановленные концентрации глутатиона в состарившихся in vivo биотинилированных эритроцитах собак. Положительные (▾) биотинилированные и отрицательные (○) эритроциты были изолированы от собаки № 1630 в указанные моменты времени после биотинилирования посредством магнитной сортировки клеток. Кроме того, предварительная сортировка (•) образца эритроцитов была взята у собаки № 1630 перед каждой сепарацией посредством сортировки магнитных ячеек. Образцы анализировали в трех экземплярах на содержание внутриклеточного восстановленного глутатиона, и показано среднее значение (± стандартное отклонение).

Рис. 1.

Внутриклеточные восстановленные концентрации глутатиона в биотинилированных эритроцитах собак in vivo. Положительные (▾) биотинилированные и отрицательные (○) эритроциты были изолированы от собаки № 1630 в указанные моменты времени после биотинилирования посредством магнитной сортировки клеток. Кроме того, предварительная сортировка (•) образца эритроцитов была взята у собаки № 1630 перед каждой сепарацией посредством сортировки магнитных ячеек. Образцы анализировали в трех экземплярах на содержание внутриклеточного восстановленного глутатиона, и показано среднее значение (± стандартное отклонение).

В ходе этих исследований мы попытались изучить состояние агрегации полосы 3 в C ₁₂ E ₈ мембранах, извлеченных из привидения собаки, методом эксклюзионной высокоэффективной жидкостной хроматографии.50 Однако мы обнаружили, что очень трудно извлечь спектрин и актин из мембран эритроцитов собак при подготовке к анализу размера кластера полосы 3. Также было проблематично выделить количество стареющих клеток, необходимое для вышеуказанного анализа. Следовательно, мы решили искать изменения в свойствах полосы 3, используя методологию, которую можно было бы легко провести на небольших количествах целых клеток.

Метод флюоресцентной микродеформации (FIMD) был первоначально разработан для оценки распределения меченых молекулярных компонентов в биологической мембране во время механически индуцированной деформации этой мембраны.45,46 Используя эту технику, Discher et al45 показали, что полоса 3, которая обычно на 30% связана с мембранным скелетом, 50,51 демонстрирует градиент концентрации при деформации, который является промежуточным между свободно текущим липидом и скелетно прикрепленными белками. В настоящем исследовании мы использовали FIMD для оценки характера распределения меченой полосы 3 в эритроците собаки в зависимости от возраста клеток. Положительные (биотинилированные) и отрицательные эритроциты, выделенные с помощью магнитной сортировки клеток, флуоресцентно метили малеимидом эозина (специфичным для полосы 3) и аспирировали в микропипетку.Были собраны и проанализированы флуоресцентные изображения деформированных клеток. Рисунок 3 иллюстрирует использованную технику и результаты, полученные с положительными и отрицательными клетками, собранными у собаки № 16:30 на 112 сутки после биотинилирования. Как показано на рис. 3, входная плотность полосы 3 (ρ _e ) увеличивается, а верхняя плотность полосы 3 (ρ _c ) уменьшается с увеличением длины выступа (L / R _p ). Однако степень увеличения ρ _e и степень уменьшения ρ _c была ниже для положительных ячеек по сравнению с отрицательными ячейками.Этот результат проиллюстрирован графиком зависимости ρ _e — ρ _c от L / R _p . Положительные клетки имели линейный наклон 0,114, в то время как отрицательные клетки давали более крутой наклон 0,150. Подобные изменения были также отмечены для положительных и отрицательных клеток, выделенных на 93 и 107 день после биотинилирования. Поскольку наклон этого графика является мерой «цито-связности» полосы 3, можно сделать вывод, что количество молекул полосы 3, прикрепленных к нижележащему скелету мембраны в стареющих эритроцитах собак, сокращается на 25% по сравнению со случайными старые эритроциты.Важно отметить, что никаких различий в значениях ρ _e и ρ _c не было отмечено между положительными и отрицательными клетками, выделенными на 58 день после биотинилирования. Хотя общая применимость этих результатов к другим собакам и людям потребует дальнейшего анализа, существующие данные, тем не менее, предполагают, что подвижность полосы 3 увеличивается в конце продолжительности жизни эритроцитов.

Рис. 3.

Микродеформация, полученная с помощью флуоресцентного изображения (от A до C), и сравнение разницы во входе и плотности покрытия для полосы 3 в положительных и отрицательных эритроцитах собак (с D по F).(От A до C) Яркое изображение эритроцитов, аспирированных микропипеткой (A), эквивалентное флуоресцентное изображение (B) и интегрированный профиль плотности флуоресценции (C), используемых для анализа. Собранные профили плотности отрицательных (D) и положительных эритроцитов (E) через 112 дней после биотинилирования нанесены на графики (D) и (E), соответственно. Составные данные ρ _e -ρ _c против L / R _p для положительных и отрицательных ячеек показаны на (F).

Рис. 3.

Микродеформация, полученная с помощью флуоресцентного изображения (от A до C), и сравнение разницы во входе и плотности покрытия для полосы 3 в положительных и отрицательных эритроцитах собак (с D по F).(От A до C) Яркое изображение эритроцитов, аспирированных микропипеткой (A), эквивалентное флуоресцентное изображение (B) и интегрированный профиль плотности флуоресценции (C), используемых для анализа. Собранные профили плотности отрицательных (D) и положительных эритроцитов (E) через 112 дней после биотинилирования нанесены на графики (D) и (E), соответственно. Составные данные ρ _e -ρ _c против L / R _p для положительных и отрицательных ячеек показаны на (F).

То же, что и человеческий белок 4.1, собачий белок 4.1 превращается из 4.1b в 4.1a за счет дезамидирования аспарагина 502 в зависимости от времени.55 Интересно, что это простое преобразование аспарагина 502 в аспарагиновую кислоту сопровождается увеличением кажущейся молекулярной массы на 4.1. b (78 кДа) по сравнению с 4.1а (80 кДа) на SDS-полиакриламидных гелях. На рис. 5 показан рисунок полос 3, 4.1 и 4.2 мембранных белков эритроцитов собак на SDS-полиакриламидных гелях, окрашенных бриллиантовым синим Кумасси, в зависимости от возраста клеток. Контрольные мембраны, полученные из клеток, полученных до биотинилирования, представляют собой случайную возрастную популяцию клеток (средний возраст клеток ≈55 дней) и содержат примерно 60% 4.1а и 40% 4.1b (рис. 5, контрольные полосы). На Фигуре 5А показана картина полосатости белков 4.1 видов в клетках, которые не ассоциировались с покрытыми авидином шариками (отрицательная фракция). Поскольку ≥97% всех эритроцитов изначально были биотинилированы, предполагается, что эти отрицательно отсортированные клетки не старше того дня, в который они были изолированы. Более того, их средний возраст должен составлять только половину этого возраста «изоляции», потому что новые небиотинилированные клетки будут добавляться к популяции ежедневно. Как и ожидалось, белок 4.1 в отрицательной фракции эритроцитов изначально был обогащен 4,1b (образец на 23 день; средний возраст клеток ≈12 дней) и со временем показал концентрации белка 4.1a и 4.1b, которые являются репрезентативными для случайной возрастной популяции клеток (рис. 5A, с 58 по 112 день). На рис. 5B и C показано превращение 4.1b в 4.1a в биотинилированных (положительных) клетках как функцию увеличения возраста клеток. Неожиданно было почти полное превращение 4.1b в 4.1a в клетках, выделенных на 58-й день после биотинилирования для обеих собак №1. 1630 (Рис. 5B) и собаки №5005 (рис. 5C). Эта скорость дезамидирования собачьего белка 4.1b, по-видимому, значительно выше, чем то, что ранее сообщалось для человеческого белка 4.1 (см. Обсуждение) 56.

Рис. 5.

Анализ SDS-PAGE белка 4.1 в мембранах эритроцитов собак определенного возраста. Эритроциты были изолированы от собаки № 1630 или номер собаки. 5005 в указанные моменты времени после биотинилирования посредством магнитной сортировки клеток и призрачных мембран получали, как описано в разделе «Материалы и методы».Эквивалентные количества (20 мкг) мембранного белка подвергали электрофорезу в градиентных (от 6% до 12%) полиакриламидных гелях и окрашивали на белок кумасси бриллиантовым синим. (A) Мембраны из небиотинилированных клеток собаки № 1630; (B) мембраны из биотинилированных клеток собаки № 1630; (C) мембраны из биотинилированных клеток собаки № 5005. C обозначает контрольные клетки, не подвергнутые биотин-авидиновой сортировке.

Рис. 5.

SDS-PAGE анализ белка 4.1 в мембранах эритроцитов собак определенного возраста. Эритроциты были изолированы от собаки № 1630 или номер собаки. 5005 в указанные моменты времени после биотинилирования посредством магнитной сортировки клеток и призрачных мембран получали, как описано в разделе «Материалы и методы». Эквивалентные количества (20 мкг) мембранного белка подвергали электрофорезу в градиентных (от 6% до 12%) полиакриламидных гелях и окрашивали на белок кумасси бриллиантовым синим. (A) Мембраны из небиотинилированных клеток собаки № 1630; (B) мембраны из биотинилированных клеток собаки №1630; (C) мембраны из биотинилированных клеток собаки № 5005. C обозначает контрольные клетки, не подвергнутые биотин-авидиновой сортировке.

Мы и другие предложили механизм распознавания и удаления стареющих клеток, который зависит от перераспределения трансмембранного белка, полосы 3.23-29 В частности, мы показали, что окислительная денатурация Hb приводит к образованию кластеров полосы 3 из-за активная ассоциация между гемихромами и цитоплазматическим доменом полосы 3.23,57-59 Эти кластеры полосы 3 на стареющих клетках распознаются иммунной системой как чужеродные и становятся опсонизированными аутологичным IgG и комплементом. 24,26,27,31-34 При отложении достаточного количества антител и комплемента стареющие клетки становятся затем распознаются макрофагами и удаляются из кровообращения путем фагоцитоза.1,39,40 В этом отчете мы впервые исследовали этот механизм удаления эритроцитов, используя клетки известного возраста, которым позволили стареть естественными механизмами in vivo.

Глобин иммуноблоттинг в этом отчете подтверждает, что ключевой этап в предполагаемом пути старения эритроцитов, то есть денатурация и отложение глобина на мембране, происходит в самом конце жизни эритроцитов.Этот результат согласуется с данными Morrison et al, 4, которые использовали метод гипертрансфузии мышей, чтобы показать, что мембраны эритроцитов мышей связывают увеличенный глобин только в самом конце их жизни. Интересно, что иммуноблот на фиг. 2 показал, что большая часть глобина, которая стала ассоциироваться с мембраной в конце периода жизни эритроцитов, была ковалентно сшита и устойчива к восстановлению дитиотреитолом 100 ммоль / л. Следовательно, поперечно-сшитые разновидности глобина могут быть стабилизированы не дисульфидными связями, а скорее невосстанавливаемыми связями, такими как амиды или аддукты, генерируемые свободными радикалами, например битирозин.Подобные типы невосстанавливаемых поперечно-сшитых глобинов были зарегистрированы при лечении Hb in vitro свободными радикалами. 60-62

Поскольку можно ожидать, что окислительная денатурация гемоглобина может возникнуть в клетках, страдающих от сниженной внутриклеточной восстановительной способности, мы также проанализировали внутриклеточную концентрацию GSH в нескольких возрастных фракциях циркулирующих эритроцитов собак. Наблюдаемое позднее снижение содержания GSH на 70%, по-видимому, противоречит предыдущим исследованиям, изучающим концентрацию глутатиона в стареющих эритроцитах кролика10 и плотных эритроцитах человека.63 Помимо разновидностей разновидностей, одно из возможных объяснений различия между нашими данными и данными, полученными на кролике, заключается в том, что эритроциты собак с дефицитом GSH были собраны на значительно более старом этапе продолжительности жизни эритроцитов, чем эритроциты кролика. В частности, эритроциты кроликов были проанализированы на ≈85% от их общей продолжительности жизни (60 дней / всего ≈70 дней) 18,19, тогда как эритроциты собак были в основном в конце их общей продолжительности жизни (≈115 дней). Однако Piccinini et al63 выделили наиболее плотный 0.4% человеческих эритроцитов, и не было обнаружено значительного снижения внутриклеточного восстановленного GSH. Это различие между нашими данными и их разделенными по плотности человеческими эритроцитами может отражать различные популяции эритроцитов, отобранные с помощью методов плотности и биотин-зависимой изоляции, или же может отражать различия в антиоксидантных системах, используемых собаками и людьми. Более конкретно, эритроциты собак содержат примерно 1/40 активности каталазы, присутствующей в эритроцитах человека.64 Это снижение активности каталазы может вызвать у собак повышенную зависимость от глутатионпероксидазы.Каким бы ни было объяснение этого несоответствия между уровнями GSH в стареющих эритроцитах человека, кролика и собак, данные, по-видимому, указывают на то, что эритроциты собак страдают от тяжелого оксидантного стресса в конце своей жизни. Сильно сшитая природа агрегатов гемихром-белок из плотных человеческих клеток33 также, по-видимому, предполагает, что окислительный стресс выражен в стареющих человеческих клетках. Если предположить, что уровень GSH не уменьшается из-за такого стресса, будет интересно узнать, какая антиоксидантная система нарушена на поздних этапах жизни эритроцитов человека.

Основываясь на нашем анализе микродеформации с помощью флуоресцентного изображения, был сделан вывод, что полоса 3 менее ограничена мембранным скелетом в стареющих эритроцитах, чем в более молодых эритроцитах. Одна возможность для этого изменения состоит в том, что отделившаяся популяция состоит из нормальных молекул полосы 3, которые просто утратили свою способность связывать анкирин в результате окисления цистеина 201 или цистеина 317.65 Альтернативное объяснение состоит в том, что недавно отделившиеся полипептиды полосы 3 включают фракция переносчиков анионов, которые уже были собраны в микроскопические агрегаты гемихромами.Поскольку гемихромы агрессивно конкурируют за часть сайта связывания анкирина на полосе 3,25,66, можно предположить, что эта агрегированная популяция также свободна от скелетных ограничений.

В настоящем исследовании мы обнаружили, что связывание аутологичных IgG резко увеличивалось в самом конце жизни эритроцитов собаки. Эритроциты собак старше 107 дней связывают ≈150 молекул IgG, тогда как эритроциты со случайным возрастом связывают только ≈20 молекул.Это семикратное увеличение связывания IgG хорошо согласуется с нашим предварительным исследованием, в котором были исследованы эритроциты возрастом ≥104 дней.41 Эти данные также согласуются с повышенным связыванием IgG, наблюдаемым в клетках человека, выделенных центрифугированием плотности2,33, и в клетках мыши, собранных после серийных исследований. гипертрансфузии.9 Однако, используя систему биотинилирования для получения эритроцитов кролика, Дейл и Дэниэлс14 не обнаружили увеличения количества связывания аутологичных IgG в течение продолжительности жизни эритроцитов кролика. Как мы обсуждали ранее, 41 разница в связывании IgG между эритроцитами кроликов и собак в позднем сроке беременности, скорее всего, связана с различиями видов в механизмах, управляющих удалением эритроцитов.

Хотя мы не пытались исследовать фагоцитоз стареющих эритроцитов собак, Сингер и др. Показали, что эритроциты, выделенные из гипертрансфузированных мышей в конце их жизни, фагоцитируются в четыре раза более агрессивно, чем эритроциты мышей произвольного возраста. Вдобавок было показано, что самая плотная фракция эритроцитов человека, которая, как сообщается, содержит от 100 до 600 молекул IgG на клетку, претерпевает ощутимо повышенный фагоцитоз in vitro.2 В зависимости от используемых условий обычно считается, что от 100 до более 4000 молекул IgG должны связываться с эритроцитами, чтобы инициировать фагоцитоз.67-70 Кроме того, подкласс IgG, распределение антитела на клеточной поверхности (сгруппированные против диспергированных). ), и последующая степень опсонизации комплементом может модулировать фагоцитарный ответ. 39,52,67,71 Таким образом, хотя мы не проводили анализ фагоцитоза с использованием наших стареющих эритроцитов собак, мы прогнозируем, что 150 молекул IgG связываются с каждой стареющей собакой. RBC достаточно, чтобы инициировать их удаление из кровотока.

Определение точного развития событий, ответственных за распознавание и удаление стареющих эритроцитов in vivo, остается сложной задачей. Однако увеличение количества связанных с мембраной цепей глобина, впервые наблюдаемое в клетках, выделенных через 86 дней после биотинилирования (рис. 2), происходит примерно в то же время, что и усиление связывания IgG и уменьшение прикрепления полосы 3 к скелету мембраны. Эти наблюдения подтверждают нашу гипотезу о том, что индукция связывания IgG со стареющими эритроцитами тесно связана с отложением глобина на внутренней поверхности мембраны.Интересно, что в то время как повышенный уровень связанного с мембраной глобина был обнаружен в популяции клеток возрастом ≥86 дней (средний возраст клеток ≈100 дней), мы обнаружили, что внутриклеточные концентрации GSH не начинали снижаться до тех пор, пока клетки не достигли возраста ≥113 дней. Это замедленное снижение уровня цитозольного GSH может указывать на то, что его снижение является скорее следствием, чем причиной отложения глобина на мембране. В самом деле, окислительный стресс, сопровождающий денатурацию гемоглобина (для обзора, см. Hebbel and Eaton, 72 и Chiu and Lubin73), потенциально может усилить локализованный окислительно-восстановительный дефицит в более глобальную клеточную проблему.

Хотя дезамидирование белков с 4.1b по 4.1a не имеет известных функциональных последствий, оно часто используется для проверки того, что популяция изолированных эритроцитов достигает старения.5,74 Meuller et al, 5 с использованием метода серийной гипертрансфузии для определения возраста мышиные эритроциты были первыми, кто показал, что белок 4.1b постепенно превращается в 4.1a в течение продолжительности жизни эритроцитов. Наш анализ возрастных мембран эритроцитов с помощью гель-электрофореза показывает почти полное превращение 4.1b — 4.1a в клетках, выделенных через 58 дней после биотинилирования in vivo. Поскольку практически все эритроциты были биотинилированы в день 0, и поскольку частичная когорта молодых клеток была индуцирована флеботомией с пребиотинилированием, умеренная фракция биотинилированных клеток должна была быть не старше 58-62 дней (средний возраст клеток <87 дней). . Таким образом, отсутствие какого-либо остаточного белка 4.1b в клетках, выделенных на 58-й день, вряд ли было следствием необъяснимо старого образца биотинилированных клеток. Любопытно, что период полураспада для дезамидирования аспарагина 502 у человека составляет ≈41 день.56 Поскольку мы наблюдаем полное превращение 4.1b в 4.1a в течение того же периода времени, мы предполагаем, что скорость дезамидирования аспарагина 502 у собак ускоряется и что популяции эритроцитов собак, обогащенные протеином 4.1a, не обязательно состоят из старых эритроцитов. .

Если предположить, что степень дезамидирования аспарагина 502 действительно различается у разных видов млекопитающих, какой механизм можно предложить для объяснения этой изменчивости? Из-за образования промежуточных продуктов сукцинимидного кольца, 75 было показано, что на скорость дезамидирования аспарагина влияет аминокислота на карбоксильной стороне остатка аспарагина.75,76 В частности, скорость дезамидирования выше в последовательностях аспарагин-серин, чем в последовательностях аспарагин-аланин.76 Инаба и соавт. в течение продолжительности жизни эритроцитов человека. Однако серин следует сразу за аспарагином 502 в последовательности собачьего белка 4.1.55. Таким образом, согласно правилам, регулирующим дезамидирование аспарагина, скорость превращения собачьего белка 4.Можно ожидать, что 1b в 4.1a будет быстрее, чем преобразование, наблюдаемое у людей.

В заключение, собака представляет собой полезную животную модель старения эритроцитов человека из-за сходной продолжительности жизни эритроцитов и сильно зависящего от возраста пути удаления эритроцитов. Хотя не все аспекты гипотезы кластеризации полосы 3 удаления эритроцитов могут быть оценены в этой модели, многие важные элементы гипотезы были впервые подтверждены в клетках, которым разрешено стареть in vivo до известного возраста.Мы пришли к выводу, что опсонизация стареющих эритроцитов, предположительно в стабилизированных гемихромом кластерах полосы 3,24,31-34, все еще представляет собой вероятный путь для объяснения распознавания и удаления стареющих эритроцитов.

Частично поддерживается грантами Национальных институтов здравоохранения № GM24417 и DK 26263.

Расходы на публикацию этой статьи были частично оплачены за счет оплаты страницы.Таким образом, данная статья должна быть помечена как «реклама » в соответствии с 18 U.S.C. раздел 1734 исключительно для указания этого факта.

(PDF) Образцы активности и временное разделение ниш собак и диких млекопитающих среднего размера в городских парках Халапы, Мексика

Фуллер Т.К., Сайфер Б. (2004) Серая лисица (Urocyon cinereoargenteus). В:

Sillero-Zubiri C, Hoffmann M, Macdonald DW (ред.) Псовые: лисы,

волки, шакалы и собаки.Обзор состояния и план природоохранного мероприятия

. IUCN / SSC Canid Specialist Group, Гланд, Швейцария и

Cambridge

García E (1981) Modificaciones al sistema de clasificación climática de

Köppen (para adaptarlo a las condiciones de la República

). Instituto de Geografía, Universidad Nacional

Autónoma de México, Ciudad de México

George SL, Crooks KR (2006) Отдых и деятельность крупных млекопитающих в

городском заповеднике.Биол Консерв 133: 107–117. https://doi.org/

10.1016 / j.biocon.2006.05.024

Gerber BD, Karpanty SM, Randrianantenaina J (2012) Модели активности

хищников в тропических лесах Мадагаскара: последствия для

видов сосуществование. J Mammal 93: 667–676. https://doi.org/10.

1644/11-MAMM-A-265.1

Гилберт О.Л. (1989) Экология городской среды обитания. Chapman & Hall,

London

Gómez H, Wallace RB, Ayala G, Tejada R (2005) Активность сухого сезона

периода некоторых амазонских млекопитающих.Stud Neotrop Fauna Environ

40: 91–95. https://doi.org/10.1080/01650520500129638

Gompper ME (2014) Собаки на свободном выгуле и охрана дикой природы.

Oxford University Press, Oxford

González G, Sánchez V, ñiguez L, Santana E, Fuller T (1992) Покровители

de actividad de coyote (Canis latrans), la zorra gris (Urocyon

elgenlacu taccine) (Didelphis virginiana) enla

Сьерра-де-Манантлан, Халиско. An Inst Biol Univ Nac Auton Mex

Ser Zool 63: 293–299

González-Romero A, López-González CA (1993).Reconocimiento

preliminar de la mastofauna asociada a las zonas suburbanas de

Xalapa y Coatepec. В: López-Moreno IR (ed) Ecología urbana

aplicada a la ciudad de Xalapa. Instituto de Ecología, Программа

о человеке и биосфере, Ayuntamiento de Xalapa, Xalapa, pp

223–243

Halle S (2000) Экологическая значимость моделей повседневной деятельности. В: Halle S,

Stenseth NC (eds) Модели активности у мелких млекопитающих. Springer,

Berlin, pp 67–90

Harrison RL (1997) Сравнение экологии серых лисиц между жилыми и неосвоенными сельскими ландшафтами.Дж. Вильдл Манаг 61: 112–122.

https://doi.org/10.2307/3802420

Hernández Rivera MG, Torres Hernández L (2015) Análisis de dos áreas

naturales protegidas en relación con el crecimiento del Árealzapropolit,

. Investigation Geográficas, Boletín

del Inst Geogr 2015: 51–61. https://doi.org/10.14350/rig.39077

Heurich M, Hilger A, Küchenhoff H et al (2014) Образцы активности евразийской рыси

модулируются световым режимом и индивидуальными особенностями

в широком диапазоне широт. .PLoS One 9: e114143. https://doi.org/

10.1371 / journal.pone.0114143

Hughes J, Macdonald DW (2013) Обзор взаимодействия между

домашних собак, находящихся в свободном перемещении, и дикими животными. Biol Conserv 157: 341–

351. https://doi.org/10.1016/j.biocon.2012.07.005

Hurlbert SH (1978) Измерение перекрытия ниш и некоторых относительных величин. Экология 59: 67–77. https://doi.org/10.2307/1936632

IkedaT, UchidaK, MatsuuraY, TakahashiH, YoshidaT, KajiK,

Koizumi I. Интенсивная камера-съемка с ловушкой

.PLoS One 11: e0163602. https://doi.org/10.1371/

journal.pone.0163602

INEGI (Instituto Nacional de Estadística Geografía e Informática) (2009)

Prontuario de información geográficaunicipal de los Estados Unidos

. Xalapa, Veracruz de Ignacio de la Llave, clave

geoestadística 30087. Xalapa

INEGI (Instituto Nacional de Estadística Geografía e Informática) (2015)

Panorama socialdemográcensal de Veracaestadístico.

Ciudad de México. internet.contenidos.inegi.org.mx/…serv/…/

inter_censal / Panorama / 702825082420.pdf / .Accessed10June2018

Lessa I, Guimarães TCS, Bergallo HG, Cunha A, Vieira EM (2016)

Домашние собаки на охраняемых территориях: угроза для бразильских млекопитающих?

Natureza & Conservação 14: 46–56. https://doi.org/10.1016/j.ncon.

2016.05.001

Левинс Р. (1968) Эволюция в меняющихся условиях: некоторые теоретические исследования

.Принстонский университет, Нью-Джерси

Linkie M, Ridout MS (2011) Оценка взаимодействия тигра и добычи в

тропических лесах Суматры. Дж. Зоол 284: 224–229. https://doi.org/10.1111/

j.1469-7998.2011.00801.x

Lira-torres I, Briones-Salas M (2012) Abundancia relativa y patrones de

actividad de los mamíferos de los Chimalapas, Оахака. Мексика

Acta Zool Mex 28: 566–585

Maffei L, Noss AJ, Cuéllar E, Rumiz DI (2005) Ocelot (Felis pardalis)

плотность популяции, активность и поведение в засушливых лесах —

восточной Боливии: данные фотоаппарата.J Trop Ecol 21:

349–353. https://doi.org/10.1017/S0266467405002397

Manjarrés-Rodríguez TS (2015) Dieta del Perro (Canis ownis) ysus

интеракции с фауной silvestre de la cuenca alta del Rombia Otún- ​​

Rombia Otún- ​​

Rombia Otún- ​​

. Диссертация, Pontificia Universidad

Javeriana

McKinney ML (2002) Урбанизация, биоразнообразие и сохранение.

BioScience 52: 883–890. https://doi.org/10.1641/0006-3568(2002)

052 [0883: UBAC] 2.0.CO; 2

Mella-Méndez I (2015) Impacto de perros y gatos de vida libre sobre la

comunidad de mamíferos medianos en áreas naturales protegidas

urbanas de Xalapa, Veracruz, Mexico. Диссертация, Университет

Веракрузана

Мередит М., Ридаут М. (2016) Перекрытие: оценки коэффициента перекрытия

для моделей активности животных. Пакет R версии 0.2.6. https: //

CRAN.R-project.org/package=overlap. По состоянию на 14 марта 2018 г.

Mitchell BD, Banks PB (2005). Исключают ли дикие собаки лис? Доказательства

для конкуренции из-за диетического и пространственного совпадения.Austral Ecol 30:

581–591. https://doi.org/10.1111/j.1442-9993.2005.01473.x

Monroy-Vilchis O, Rodríguez-Soto C, Zarco-González M, Urios V

(2009) Использование среды обитания пумы и ягуара и деятельность узоры в

Центральной Мексике. Anim Biol 59: 145–157. https://doi.org/10.1163/

157075609X437673

Monroy-Vilchis O, Zarco-González MM, Ramírez-Pulido J, Aguilera-

Reyes U (2011) Diversidad de mamíferos de la 9000anchis Natural

, Мексика.Rev Mex Biodiv 82: 237–248

Monterroso P, Alves PC, Ferreras P (2013) Поймай меня, если сможешь: diel

паттерны активности хищников и жертв среди млекопитающих. Этология 119:

1044–1056. https://doi.org/10.1111/eth.12156

Mora-Ascencio P, Mendoza-Durán A, Chávez C (2010) Densidad

poblacional y daños ocasionados por la ardilla Sciurus aureogaster:

de conservaciones los Viveros de Coyoacán,

México. Rev Mex Mastozool 14: 7–22

Nielsen AB, van den Bosch M, Maruthaveeran S, van den Bosch CK

(2014) Видовое богатство городских парков и его движущие силы: обзор

эмпирических данных.Городской Экосист 17: 305–327. https://doi.org/10.

1007 / s11252-013-0316-1

Новак Р. (1991) Млекопитающие Уокера в мире. Johns Hopkins

University Press, Балтимор

Paschoal AMO, Massara RL, Santos JL, Chiarello AG (2012) Становится ли домашняя собака

массовым видом в атлантических лесах?

Пример исследования на юго-востоке Бразилии. Mammalia 76: 67–76. https: //

doi.org/10.1515/mammalia-2012-0501

Phillips AJK, Fulcher BD, Robinson PA, Klerman EB (2013)

Модели отдыха / активности млекопитающих, объясненные физиологически моделированием на основе

.