Йоркширский терьер (Йорк) — все о породе, описание и характеристика

Йоркширский терьер

Активность

10.0/10

Склонность к дрессировке

8.0/10

Отношение к детям

8.0/10

Если хотите иметь в своем доме собачку-игрушку, которая, несмотря на маленький размер, обладает характером бесстрашного охотника, непременно заведите себе йоркширского терьера. Представители этой английской породы с виду действительно похожи на мягкую игрушку, но на самом деле являются настоящими терьерами.

Содержание:

История возникновения породы

Можно с уверенностью сказать, что популярность йоркширских терьеров неизменно растет. Оно и не удивительно, ведь эти милые малютки являются верными и преданными компаньонами.
Благодарить за появление этой прекрасной породы стоит англичан. В конце девятнадцатого века в графстве Йоркшир началась история йоркширских терьеров.

Йорки появились совсем не как комнатно-декоративная собачка, изначально их вывели английские крестьяне для защиты жилища от крыс и других мелких грызунов и лишь впоследствии эти бесстрашные маленькие терьеры утратили свое охотничье предназначение и вошли в список самых популярных декоративных пород собак.

Со своей Родины йоркширские терьеры медленно, но верно распространились по всем странам Земного шара. Например, в Америке эти милые собачки обосновались в 1872 году, в России же они появились лишь в 1971 году.
Сейчас считается престижным иметь в доме чистопородного йоркширского терьера, но покупают и любят их не только из-за статуса. Маленькие йорки с первого мгновения способны вызвать у человека к себе любовь, нежность и желание защитить.

Стандарт породы

Если обобщенно говорить о внешнем виде йоркширских терьеров, то вес их согласно стандартам не должен превышать 3,1 кг, шерсть длинная, равномерно свисающая по бокам, корпус сильный, осанка важная.

Конечно, такого короткого описания йорк не заслуживает, поэтому остановимся поподробнее на экстерьере этой породы:

Шея длинная, голова небольшая, плоская, уши высоко и не очень далеко посажены, также небольшие, имеют V-образную форму, покрыты короткой шерстью. Морда слегка широковата, прикус ножницеобразный, ровный. Челюсти ровные, плотно сжатые, зубы стоят вертикально. Мочка носа черная. Глаза небольшие, темные, прямо посаженные, взгляд ясный, очень выразительный, смышленый. Край век окрашен в черный цвет.

Корпус компактный с немного выпуклой грудью, спина ровная, поясница крепкая, прямая.

И передние, и задние конечности прямые, ровные, плечи расположены хорошо, углы задних конечностей выражены умеренно. И передние и задние конечности сильно покрыты шерстью, цвет которой немного отличается от кончиков до корней — у корней шерсть на несколько тонов темнее. Лапы круглые, пальцы прилегают плотно, коготки черные.

Шерсть йорков длинная, прямая, блестящая и шелковистая, имеет нежную текстуру, не пушистая и не волнистая. Шерсть равномерно свисает по бокам от ровного пробора на спине.

Окрас шерсти йоркширского терьера различный на разных частях тела. Согласно стандарту породистый йоркширский терьер выглядит следующим образом:

• Голова, грудь, конечности – золотистые, красно-коричневые;
• От затылка до хвоста ниспадающая шерсть – сизо-стальная;
• Хвост – темно-голубой.

Движения легкие, свободные, с хорошим темпом, спина в движении обязательно прямая.

Содержание йоркширских терьеров

Ничего сложного в содержании йоркширского терьера нет. Неоспоримый плюс – это отсутствие проблемы обязательных прогулок. Маленькая собачка быстро приучается к туалетному лотку или специальной пелёнке, используемой в качестве туалета. Но при этом владелец йорка должен учитывать, что его питомец нуждается в прогулках, в активных играх на свежем воздухе, поэтому любую возможность для выгула непоседливой малютки нужно использовать.

Что касается прогулок с йорком, о помните, что они достаточно чувствительные собачки, так что в сильный солнцепек малыш будет страдать от жары в своей теплой шубке, а в зимнее время года придется утеплиться в теплый комбинезон или курточку.

Одежда для йорков — не только дань моде (хотя и не без этого). Из-за своего маленького роста собачки действительно мерзнут гораздо больше, чем представители крупных пород и могут легко заболеть в холодное время года.

Говоря о содержании йорков непременно нужно затронуть тему безопасности. Ведь такого кроху запросто можно травмировать, прищемив дверью или наступив ненароком. В дом, где есть маленькие дети, вообще не рекомендуется брать маленького щеночка йоркширского терьера, ведь ребятишки будут думать, что это живая игрушка, а в процессе игры могут сильно сжать или бросить на пол беззащитное животное.

Вся ответственность в таких случаях возлагается на взрослых членов семьи.
Если уж решились и приобрели йоркширского терьера, определите с первого дня личную территорию для своего питомца.

Идеальный вариант – пускай песик сам выберет для себя место. Подбирая «угол» для собаки самостоятельно, учтите следующие правила:

• На своей территории собака должна чувствовать себя в безопасности, уютно и комфортно;
• Никогда насильно не вытаскивайте животное из его «угла», ни для поощрения, ни для наказания. Личная территория питомца должна быть неприкосновенной;
• Не рекомендуется устанавливать собачью лежанку в коридоре, в проходном месте. Устройте так, чтобы со своего «угла» песик мог наблюдать за всем, что происходит в комнате;
• На территории, которую вы подобрали для собаки, установите матрасик, коврик или корзинку. Так как йорк относится к маленьким породам, можно установить целый маленький собачий домик.

Содержание маленького йорка в доме обязывает всех домочадцев быть более внимательными, осторожными. Нужно обеспечить четвероногому питомцу безопасность, защиту, любовь и ласку. Касаемо безопасности и сохранения здоровья обратите внимание на следующее:

• Все химические препараты уберите в места, куда не сможет попасть песик. То же самое касается лекарств;
• Если уронили на пол булавку, иголку, катушку, кусочек ваты и т.п., обязательно отыщите и поднимите. Также внимательно относитесь ко всем мелким предметам, которые может проглотить йорк. Такое незапланированное «угощение» может обернуться серьезными проблемами со здоровьем питомца, вплоть до оперативного вмешательства;
• Йоркширский терьер хоть и декоративная собачка, но в его жилах бурлит кровь настоящего охотника. Поэтому песик не упустит возможности покопаться в земле. Так что владельцу маленького пушистого землекопа стоит повыше убрать вазоны с комнатными цветами;
• Электропроводка должна быть скрыта, щенок может попробовать электрический кабель на зуб;
• Во время новогодних праздников или других подобных мероприятий следите, чтобы песик не накушался мишуры или иголок с новогодней елки. Такой обед может закончиться воспалением кишечника;
• Если не хотите испортить прикус у щенка, никогда ничего насильно не тяните у него изо рта;
• Следите, чтобы маленький питомец не выходит на неогороженную лестницу или балкон.
  При возникших вопросах по воспитанию, содержанию, здоровью собаки обращайтесь к специалистам.

Уход за Йорками

Такие собаки, как йоркширский терьер требуют особого ухода. Все дело в их роскошной длинной шерсти, всего на пару дней оставьте длинношерстного красавца один на один с его локонами, и они превратятся в колтуны, с которыми так сложно бороться. Но не стоит думать, что только шерстка йорков требует внимания. Рассмотрим подробно все пункты ухода за маленьким питомцем:

Глаза. Ежедневно следует протирать, используя ватный тампон, смоченный в воде. Такая процедура способствует удалению выделений. Если этого не делать, глазные выделения, смешиваясь с пылью, попадают в глаза, что может привести к конъюнктивиту.

Зубы. Скажете, что зубная щеточка нужна только человеку, но на самом деле зубки вашего четвероногого питомца также нуждаются в зубной щетке и в регулярной чистке. Если этого не делать наверняка у песика образуется «нерушимый» зубной налет, а затем и камни. Если не хотите использовать для чистки собачьих зубов щетку, можно заменить ее специальными жевательными «косточками». В случае образования зубных отложений, с которыми владелец животного не может справиться самостоятельно, необходимо обращаться к ветеринарному врачу. Учтите, при ненадлежащем уходе у вашего питомца уже на второй год жизни могут выпадать зубы.

Когти. Для владельцев, которые подолгу и часто гуляют со своим питомцем на свежем воздухе, проблема длинных когтей отпадает сама собой. Ведь их собачки сами стачивают о дорожное покрытие отросшие коготки. Если же большую часть времени песик проводит на диванчике или на руках любящего хозяина, ему время от времени нужно подстригать когти.

Обратите внимание на нашу статью: Как стричь когти собаке. Пошаговая инструкция

Уши. Чистка ушей с использованием ватных палочек проводится один раз в 5-7 дней. Чтобы такая гигиеническая процедура проходила проще и качественнее, шерстку внутри ушных проходов удаляют.

Шерсть. Если ваш йоркширский терьер не участвует в выставках, то нет необходимости отращивать длинную до самого пола шерсть. В большинстве случаев владельцы таких собак делают своим любимцам стрижку раз в 3 месяца. Вариантов всевозможных причесок для йорков огромное множество! Несмотря на стрижку, шерстку нужно ежедневно расчесывать специальной щеткой и, конечно, купать с использованием моющих средств для длинношерстных собак.

Если же ваш йорк регулярно участвует в выставках, то его шерсть должна быть длинной. Уход за такой шерстью требует повышенного внимания. Мыть ее нужно с бальзамом, кроме мытья смазывать маслом. Делается это для того, чтобы шерстка не спутывалась, с этой же целью локоны шерсти накручивают на папильотки.

Правила кормления, рацион

В первый же день пребывания щенка йоркширского терьера в вашем доме установите для него миску для корма и миску для питьевой воды. Это должно быть такое место, где собака спокойно сможет кушать, в противном случае животное будет вытягивать из миски еду и тащить кусочки в укромный уголок, например, под стол. В большинстве случаев место для кормежки определяется в кухне, но это решение полностью на усмотрение хозяина.

Новоиспеченные владельцы собак часто совершают одну и ту же ошибку, оставляя еду в собачьих мисках на целый день. Так поступать нельзя, насыпав корм для питомца, подождите минут двадцать и убирайте миску, несмотря на то осталась еда в ней или нет. В отличие от еды, чистая, прохладная вода должна быть в доступности животного 24 часа в сутки. Не приучайте собаку к кусочничеству, не позволяйте клянчить угощение во время вашей собственной трапезы.

Начиная с первых кормежек, приучайте щенка йорка к режиму кормежки. Давать еду собаке нужно в одно и то же время. Количество кормежек и размер порций зависит от возраста, состояния здоровья питомца. Если маленького щенка нужно кормить 5-6 раз на день, то взрослому псу достаточно 2 приемов пищи.

Рацион рекомендуется составлять вместе с ветеринарным врачом, который наблюдает вашего питомца. Питание должно быть сбалансированным, собака должна получать все, необходимые для организма витамины и минералы. Владелец сам решает, какой выбрать тип кормления: натуральный или сухой. Конечно, намного легче покупать готовый корм, чем тратить время на приготовление натуральной еды. Как в первом, так и во втором случае недопустимо использовать просроченные, некачественные корма.

Взяв из питомника маленького щенка, обязательно поинтересуйтесь у заводчика, чем малыш питался до переезда на новое место жительства. Рекомендуется резко не менять привычный рацион, если все же хотите перевести песика с сухого корма на натуральные продукты, делать это нужно постепенно и очень осторожно, чтобы не допустить расстройства желудка.

Здоровье и болезни йоркширских терьеров

Природа наградила представителей породы Йоркширский терьер крепким здоровьем. Владелец, который по всем правилам кормит, содержит и ухаживает за своим маленьким питомцем, сможет наслаждаться его здоровым видом, игривым нравом и прожить рядом с ним 13-15 лет. Есть сведения о йорках-долгожителях, доживших до 20 лет, что не может не радовать.

К большому сожалению, эти симпатичные малыши, как и все живые существа на земле, иногда болеют. Йоркширские терьеры имеют свои породные заболевания, которые «атакуют» их из-за маленького размера. Владельцам йорков обязательно нужно ознакомиться со списком этих заболеваний, чтобы обратить особое внимание на их симптомы, причины возникновения и вовремя предотвратить проблемы со здоровьем. Ниже в списке представлены болезни, которые часто встречаются у йоркширских терьеров:

Крипторхизм — заболевание, характерное только для кобелей, при котором одно или два яичка не опускаются в мошонку, а остаются либо в области паха, либо в брюшной полости. Крипторхизм лечится только оперативным путем и то, только в тех случаях, если он доставляет собаке неудобство. Кобели-крипторхи не допускаются к разведению, так как этот недуг передается по наследству. На выставках кобели-крипторхи дисквалифицируются, поэтому если вы покупаете себе собаку шоу-класса, обязательно дождитесь опущения яичек в мошонку.

Проблемы с суставами (Болезнь Партесса, Вывих коленной чашечки) — заболевания, характерные для мелких пород собак, характеризующееся нарушением работы суставов. Лечение зависит от стадии заболевания — от физиотерапии до оперативного вмешательства.

Незарастание родничка. Следует помнить, что у представителей данной породы родничок может оставаться открытым на протяжении всей жизни. Сам по себе этот факт не является заболеванием, но может привести к травмам головного мозга.

Нарушение смены зубов. Из-за маленького размера челюсти у йоркширских терьеров достаточно часто встречается проблема, что коренные зубы начинают расти еще до того, как выпали молочные. Это приводит к нарушению зубного ряда, прикуса, боли и страданию животного. Хозяева йорков должны следить за сменой зубов питомца и в случае обнаружения этой проблемы, молочные зубы нужно удалять в ветеринарной клинике.

Многих проблем со здоровьем можно избежать, если регулярно проходить профилактические осмотры у ветеринарного врача и проводить плановую вакцинацию. Опытные собаководы не допускают самолечения, также избегают контактов своих питомцев с бездомными, дикими животными. Помните, что здоровье вашего питомца полностью находится в ваших руках!

Характер Йорков

Йоркширский терьер имеет непростой характер, если с первых месяцев жизни вплотную не заниматься его воспитанием, он, как говорится, сядет своему хозяину на голову и лапки свесит. Дело в том, что представители указанной породы очень упрямы и настойчивы. Йорк, в любом случае, должен добиться своей цели, будь то вкусняшка из рук хозяина или его внимание.

Упрямство миленького малыша сглаживается его преданностью и любовью к хозяину. Йорк с удовольствием играет, бегает, кушает, путешествует и спит рядом с владельцем. Это и есть самое большое счастье для собаки. Одиночества не любит, всегда старается быть поближе к членам семьи.

Увидев незнакомца или другую собаку, маленький смельчак сразу превращается в грозного охранника. Он рычит, лает и всячески пытается отогнать непрошенных, на его взгляд, гостей. Нужно время, чтобы йорк успокоился и смирился с присутствием чужаков, хотя и тогда малыш не позволяет к своей персоне излишней фамильярности.

С детьми йоркширский терьер ладит, с удовольствием играет с ними при условии, что его не будут обижать. С домашними животными эта собачка живет в относительном мире. Не забывайте, малыш очень подвижен и игрив, а для игры нужны компаньоны. Если собачка принадлежит пожилой даме, она, как бы перенимает ее способ жизни и преспокойно часами может лежать у нее на руках.

Дрессировка и воспитание

Если хотите иметь послушную собаку, уделите с раннего возраста время и средства для ее воспитания. Некоторые новички-собаководы считают, что маленькая порода не требует никакой дрессировки, это служебным породам требуется прохождение целых курсов дрессуры. Это совершенно ошибочное мнение, невоспитанный четвероногий малыш может разрушить ваше жилище и нарушить ваш покой, как ночной, так и дневной.

Йоркширские терьеры, например, обожают громко лаять и не только по причине, но и просто так, от скуки. Благодаря правильному воспитанию собачек можно отучить от этой привычки.

Чтобы определить оптимальный способ воспитания и дрессуры, нужно определить индивидуальные способности животного. Касаемо йоркширских терьеров, при их дрессировке можно использовать тот факт, что представители данной породы подвижны, энергичны, игривы и при всем этом обожают своих хозяев, любят проводить с ними время и угождать, если представится такой случай.

Стоит немножко подтолкнуть йорка к правильным действиям и показать, что от него хочет хозяин. В итоге маленький пушистик постарается выложиться на все 100%, чтобы не огорчить владельца. Наградой для йорка будет ласковое слово, поглаживание, почесывание за ушком. После занятий рекомендуется спокойно посидеть на диване с питомцем на коленях. Подобные поощрения способствуют успешной дрессировке.

Если вы считаете, что дрессировать йоркширского терьера не обязательно, знайте, что любознательная собачка сама начнет познавать окружающий мир без вашей помощи. Например, какие на вкус ваши туфли, что можно найти в цветочном вазоне или что происходит за пределами квартиры. Лучше, если владелец маленькой непоседы сам займет ум питомца и будет развивать в собачке хорошие качества.

Всем владельцам йоркширских терьеров необходимо помнить, что их предки являются охотничьими собаками. Поэтому йорки очень упрямы, любят лаять и покопаться в земле. С этим нужно и можно бороться, если, конечно, не хотите превратить декоративную собачку в охотничьего пса. Если пес проявляет агрессию или беспричинно лает, в обязательном порядке пресекайте подобные проявления. Вырастить хорошую собаку поможет вовремя начатое воспитание!

Плюсы и минусы породы

Перед тем, как приобрести собаку, необходимо все разузнать о ней, обо всех преимуществах и всех недостатках выбранной вами породы. В данной статье речь идет о йоркширских терьерах, так что будем рассматривать плюсы и минусы представителей данной породы:

Плюсы йоркширских терьеров:

• Игривость;
• Жизнерадостность;
• Сообразительность и ловкость;
• Нет необходимости в ежедневных длительных прогулках;
• Привязанность к хозяину;
• Идеальная порода для пожилых людей;
• Быстро привыкает к любым жилищным условиям.

Минусы йоркширских терьеров:

• Чрезмерной энергичностью может утомить всю семью;
• Иногда возникают проблемы с туалетом;
• Громкость, любят беспричинно лаять;
• Сложно поддаются дрессировке, особенно, если воспитание начинаете не со щенячьего возраста;
• Чрезмерное проявление к чувству собственности и ревности к хозяину;
• Повышенное внимание к уходу за длинной шерстью йорков.

Интересные факты о йоркширских терьерах

Каждое существо имеет в своей истории много разных интересных фактов. Это и не удивительно, ведь история предков, родословная, любопытные истории из жизни предыдущих поколений четвероногого воспитанника, несомненно, будут полезными и интересными владельцам йоркширских терьеров:

• В большом семействе йорков оставила свой след самая маленькая представительница по кличке Сильвия. Жила она в Англии и ей, к сожалению, довелось прожить всего два года. Рост мини-собачки был 6.3 см., вес – 112 г.
• Владельцы йорков, которые проживают на загородных территориях, должны проявлять повышенное внимание к охотничьим инстинктам своих подопечных. Дело в том, что во время прогулок по лесу песик может поймать и съесть жука или найти мышку дикую, которую потеряла сова. После подобных «угощений» собачка в большинстве случаев получит расстройство желудка.
• В истории разведения миниатюрных йорков известны случаи, когда владельцы специально давали мало кушать своим подопечным, в итоге их рост затормаживался. Целью этих горе-собачников было получить мини-собачек, но при таком содержании животные страдали. Их психика была нарушена так же, как и здоровье. Продолжительность жизни малюток заметно сокращалась.
• Знаменитостью среди многочисленного семейства йоркширских терьеров считается Хаддерсфилдский Бен. Этот песик умудрился за свою жизнь выиграть 74 приза, кроме этого песика считают «отцом породы». К сожалению, жизнь его была недолгой. В возрасте 6 лет его сбил экипаж.

Как видите, йоркширские терьеры не просто мягкие, милые, игривые собачки. Они требуют к себе внимания, в их воспитании, содержании и кормлении есть свои нюансы, с которыми необходимо считаться. В этой статье найдете много советов и рекомендаций, которые помогут вырастить из маленького щенка йорка настоящего воспитанного выставочного йоркширского терьера.

Фото Йорков из сети Internet

Please check your feed, the data was entered incorrectly.

Виды стрижек йорка — фото мальчиков и девочек

Йоркширские терьеры обладают шерстью, структура которой похожа на человеческий волос. У них нет подшерстка, поэтому уход за шерстяным покровом достаточно простой. Главное, регулярно мыть, стричь и вычесывать.

Регулярный груминг йоркширских терьеров позволяет экономить время и силы на вычесывание. Если его не делать, шерсть может дорасти до длины, превышающей рост собаки в два раза.

Вид стрижки зависит от типа волоса и пола питомца. Также учитываются:

• участие в выставках;
• характер и темперамент;
• скорость роста шерсти;
• как будет меняться прическа по мере отрастания;
• время, которое хозяин готов уделять уходу.

 

Виды стрижек йоркширских терьеров

Гигиеническая

Проводится примерно каждые две недели. Груминг сводится к тщательному расчесыванию и удалению колтунов, подравниванию волоса по всему телу и подстриганию когтей. Также удаляется шерсть на ушках, на подушечках лап, в области живота, подмышек и ануса.

До этого мастер выкупает собаку с шампунем и кондиционером, затем высушит. Это облегчит распутывание колтунов и подготовит шерсть к стрижке.

 

Косметическая

Косметическая стрижка — необходимое условие для участия в выставке. Подразумевает выстригание растительности между пальцами, в области паха и подмышек. Шерстяной покров на теле лишь немного подравнивается и тщательно расчесывается, а на макушке создается топ-кнот.

Такой уход преследует одну цель — максимально сохранить естественный вид собаки.

 

Модельная

Модельная стрижка подходит для собак, которые не принимают участие в выставке. Можно экспериментировать над внешним видом питомца. Есть множество видов модельных причесок. К ним относятся корейский стиль, имитация других пород, создание образа щенка и др. Рассмотрим их подробнее.

Разновидности модельных стрижек

Под щенка

Это самый популярный образ для йорка. Питомец стрижется коротко под машинку, длина волоса — не более 4 см. На голове волоски имеют одинаковую длину. Питомец становится визуально моложе, а его морда похожа на щенячью. 

Такая стрижка сводит мытье и вычесывание к минимуму. За ней легко ухаживать. Это отличный вариант для лета.

 

Квадратная

Она похожа на прическу «под щенка». Покров на лапах и теле стрижется коротко. На голове волос обрабатывается таким образом, чтобы мордочка напоминала квадрат. На кончики волосков наносится гель, чтобы зафиксировать форму.

 

Под шнауцера

С такой прической йоркширский терьер имеет черты, схожие со шнауцером. Шерсть на лапках остается длинной, в то время как корпус, затылок и ушки подстригаются коротко. Длинными остаются волоски на челке, щеках и бороде.

 

Под шиншиллу

Здесь питомец получает шубку, как у шиншиллы. Покров стрижется поперечными или диагональными полосками. В результате получаются слои. Они не только выглядят эффектно, но и помогают скрыть неровности спины.

 

Под китайскую хохлатую

У собачки состригается почти вся шерсть. Она остается только на лапках в виде сапожек и на хвостике в виде кисточки. На голове покров также убирается, остается лишь окантовка мордочки.

Такая прическа проста в уходе. Единственное, что «клеши» на лапках будут собирать грязь во время прогулок, поэтому мыть их придется тщательнее.

 

Корейская

Такую стрижку еще называют азиатской или японской. С ней животное приобретает игрушечный вид. На лапах шерсть почти не трогают, а вот на мордочке она срезается коротко. Туловище обрабатывается машинкой. На ушках остаются длинные очесы, чтобы была возможность делать причудливые прически.

 

Под цвергшнауцера

Очень мило смотрятся йорки со стрижкой под цверга. Лапы подстригаются под «штанишки», а корпус — полностью. Больше всего вмешательств на голове. У питомца на ушах и макушке растительность убирается. Длинный волос остается на бороде, щечках и в области бровей. Можно также оставить полосу из длинных волос вдоль тела от груди до паха.

 

Креативная

Здесь нет четких правил. Креативный груминг позволяет ставить различные эксперименты над образом питомца. На спине животного можно сделать любой рисунок, оставить полосы для кос и других причесок. Есть возможность экспериментировать с длиной. Благодаря тому, что шерстяной покров йорков растет быстро, прическу легко поменять, если опыт не понравился.

Йоркширского терьера можно не только стричь, но и покрасить. Радужные хвостики и «манжеты» вызывают умиление и делают собаку модной и заметной. Питомцу можно придать тигровый или леопардовый окрас, нанести любой рисунок. Краска не портит шерсть и не уничтожает собственный пигмент. Она безвредна для кожи, держится, пока шерсть не подстрижется.

 

Стрижка йорков-мальчиков

В груминге собак нет четкого деления по моделям для мальчиков и девочек, но многие владельцы выбирают своему питомцу прическу в соответствии с полом.

Для кобелей обычно выбирают классический образ. Многие владельцы не украшают питомцев бантиками, поэтому часто выбирают короткую прическу.

Для мальчиков хорошо подходит стрижка «а-ля шнауцер», под щенка, льва, квадратная, с длинными усами.

Стрижка йорков-девочек

Владельцы девочек хотят подчеркнуть красоту любимицы. В образе нередко присутствуют разные аксессуары: волос украшают бантиками, заколочками, лентами и др. Такой уход придает собаке роскошный и ухоженный вид.

Для девочек зачастую выбираются длинные стрижки, хотя и короткие также популярны.

Для сук йоркширского терьера хорошо подходит корейская стрижка, под хохлатую или шиншиллу.

Очень привлекательный вариант — прическа-«юбочка». Спина стрижется коротко, а внизу боков и на животе остается удлиненная шерстка.

У девочек зачастую длинная челка и волос по бокам головы, что дает большой простор для причесок и украшений.

Виды причесок

Причесывать собак можно и в домашних условиях. Наиболее популярны следующие варианты:

1. Хвостик. Его легко сделать и украсить разными аксессуарами. Наиболее удобный вариант — заколочка или резинка с бантиком. Если шерсть на лбу не слишком длинная, из хвоста получится милая пальма, которая придает собачке игривый вид. Хвостик убирает волос с глаз, и питомцу ничего не мешает.
2. Луковка. Если шерсть длинная, из нее можно сделать модную и среди людей луковку. Сначала делается обычный хвостик. Затем формируется пучок, похожий на луковицу, который закрепляется бантиком. Для собаки этот вариант также удобен, и выглядит она интересно и мило.
3. Косы. Вариантов плетения очень много. Косы создаются на голове, вдоль позвоночника или на спине. Главное, не делать тугие плетения, иначе любимцу будет некомфортно. Бантиками можно украшать не только челку, но и корпус.

Стрижка щенков йорков

Щенок требует ухода уже на 5-й день жизни. В этом возрасте ему необходимо обработать коготки. На 3-ю неделю добавляется уход за ушами.

В возрасте 1,5 месяца щенку нужно выстричь растительность в области ануса. Первая гигиеническая стрижка требуется на 4-й месяц жизни, а начиная с 6 месяцев уже можно проводить эксперименты с прическами.

Многие боятся стричь питомца до года. Считается, что это испортит шерсть. На самом деле, это не так. Щенка стричь можно и даже нужно: это не только облегчит уход, но и позволит избежать колтунов, которые быстро образуются на мягкой шерстке.

Какую стрижку выбрать в зависимости от типа шерсти

• Пушистая: йоркам с пушистым покровом очень идут корейские стрижки. Благодаря округлым формам и пушистости питомец становится очень похож на игрушечного.
• Жесткая: для таких животных подходит средняя длина волоса. Если подстричь коротко, волоски будут торчать, и йорк получит неухоженный вид. А если шерсть длинная, она не ляжет ровными прядками даже после бальзама. Такая собака, опять же, будет выглядеть неопрятно.
• Гладкая, шелковистая: йоркам с такой шерстью идут все стрижки. С таким типом покрова можно участвовать в выставках и проводить эксперименты.

Опытный грумер поможет подобрать оптимальный вариант, с которым питомец будет выглядеть привлекательно.

Короткая или длинная

Длина зависит от характера собаки и предпочтения хозяина.

Если животное активное, много времени проводит на улице, играет с детьми, ему подойдет короткая стрижка. Шерсть не будет быстро пачкаться и сбиваться в колтуны.

Если хозяин располагает временем для тщательного ухода, можно выбрать длинную прическу. Она покажет всю красоту питомца и продемонстрирует усилия владельца в уходе за любимцем.

Но какая бы стрижка ни была, йорка все равно нужно регулярно вычесывать и купать.

 

Надо ли стричь йорка на зиму?

Многие думают, что длинная шерсть йоркширского терьера согревает питомца зимой и поэтому не стригут его коротко. На самом деле, это не совсем так. У йорков нет подшерстка, поэтому волос греет тело примерно так же, как и наши волосы голову.

Во время прогулки в длинную шерсть забивается снег, грязь от песка и реагентов. Снежные комки прилипают к покрову, и при таянии дают собаке чувство озноба. Да и вымывать залежи грязи сложно.

Комбинезон позволит утеплить питомца, но длинная шерсть будет сваливаться в колтуны.

Кроме этого, зимой из-за низкой влажности волос портится и высушивается. Требуется дополнительный уход: интенсивное увлажнение и питание.

Если йорк не участвует в выставках, средняя и короткая стрижка облегчит уход зимой и не причинит дискомфорт собаке.

Уход между стрижками

Чтобы питомец сохранял опрятный вид, важно регулярно за ним ухаживать.

Животное нужно ежедневно вычесывать расческой с закругленными зубцами. Движения должны быть по направлению роста волоса, плавные и без рывков.

Если обнаружился колтун, нужно попробовать аккуратно его распутать. В этом деле отлично помогут средства на основе масла. Если не получилось, колтун нужно срезать. Но делать это стоит в крайнем случае, так как образовавшиеся проплешины не позволят создать красивую прическу потом.

Шерсть выставочного йоркширского терьера следует укладывать в папильотки, располагая их в строго определенном порядке. Как это правильно делать, можно подсмотреть у опытного грумера.

Купать собаку можно дважды в месяц. Выставочную — еженедельно. Для этого используется шампунь для длинношерстных пород. Сушат питомца двумя полотенцами — одно для удаления воды, второе — для окончательной сушки.

Где лучше стричь йорков

Подстричь можно:

• В салоне: это самый эффективный вариант. Опытные грумеры найдут подход к питомцу, сделают его ухоженным. В груминг-салоне имеется большой набор инструментов, удобная мойка и качественная косметика.
• На дому: такой вариант будет комфортен для собак, которые боятся незнакомой обстановки. Песик будет вести себя спокойно, что заметно облегчит процедуру.
• Самостоятельно: в этом случае владельцу необходимо приобрести специальный инструмент и получить базовые навыки.

Если вы выбираете груминг у специалиста, поинтересуетесь его образованием. Он должен показать как минимум диплом об окончании курсов. Будет здорово, если грумер регулярно повышает квалификацию и может подтвердить это сертификатами. Крайне важно дружелюбное отношение к питомцу. Любая грубость в отношении животного недопустима.

Не важно, что вы выберете: самостоятельный груминг или профессиональный. Главное — хорошее самочувствие вашего питомца. Регулярная забота позволит животному не только выглядеть привлекательно, но и не испытывать дискомфорт.

Голдаст йорк: характеристики породы собаки, фото, характер, правила ухода и содержания

Размер

Миниатюрный

Возраст

12–15 лет

Группа породы по МКФ

Не признана

Краткие сведения

• Очень редкая порода;

• Особая разновидность йоркширского терьера;

• Игривые, любопытные и дружелюбные.

Характер

Несмотря на то что голдаст йорк был официально признан всего лишь около десяти лет назад, абсолютно новой породой его назвать нельзя. Дело в том, что щенки золотистого цвета рождались ещё в 1980-х годах у бивер йорков — трехцветной разновидности йоркширских терьеров. Но тогда таких щенков не выделили, а посчитали новым окрасом бивер йорка.

Однако чуть позже на необычный цвет шерсти обратила внимание биолог Кристен Санчес-Мейер. Она решила выяснить причины его происхождения. Оказалось, что за этот цвет отвечает особенный рецессивный ген, носителем которого являются некоторые йоркширские терьеры и бивер йорки. Это стало определяющим моментом для выделения новой породы. Кстати, название «голдаст» (gold dust) буквально переводится с английского как «золотая пыль».

Голдаст йорк, как и его старший товарищ йоркширский терьер, — небольшая, веселая и очень активная собака. Это отличный компаньон как для семей с детьми, так и для одиноких людей. Представители породы очень общительны и дружелюбны. Если большинство собак всё же с опаской относится к незнакомым людям, то голдаст йорки — приятное исключение. Они с радостью знакомятся с гостями дома и всем своим видом демонстрируют добродушие и гостеприимство. Вместе с тем голдаст йорки не глупы и не наивны, это умный и любопытный питомец. Он способен понимать хозяина с полуслова! Поэтому представителей этой породы дрессировать легко и совсем не утомительно. Голдаст наверняка по достоинству оценит развивающие игрушки.

Представители этой породы сильно привязываются к своему хозяину, а потому оставлять собаку надолго в одиночестве крайне не рекомендуется: питомец нуждается в общении и без него начинает тосковать и грустить. Если рабочий график не позволяет вам весь день проводить с собакой, можете завести сразу пару голдаст йорков — вместе им точно не будет скучно.

С другими животными голдаст тоже вполне способен ужиться. Правда, маленький пес может попытаться стать лидером, и поэтому с питомцами, которые не готовы мириться с таким положением дел, могут возникать небольшие конфликты. Впрочем, со временем животные найдут общий язык.

Голдаст йорк с его миловидной внешностью покорит любого ребёнка. Да и сам питомец к детям относится очень лояльно. Но малышам необходимо объяснить правила общения с собакой, потому что поранить или травмировать её очень легко.

Едете на дачу или собираетесь путешествовать с питомцем?

Зоомагазин Petshop дарит скидку на переноски и аксессуары! Подпишитесь на рассылку и получите скидку

Спасибо за подписку!

Уход

Роскошная шерсть голдаст йорка требует внимательного ухода. Собаке можно делать стрижки, а можно оставить питомца с длинной шерстью. У голдастов нет подшерстка, поэтому линька проходит не очень интенсивно, а шерсть почти не сваливается в колтуны. Расчесывать собаку следует каждую неделю, а купать достаточно дважды в месяц. По мере необходимости надо стричь подросшие когти, а также чистить глаза и зубы собаки.

Условия содержания

Голдаст йорки отлично чувствуют себя в условиях городской квартиры. Их можно приучить к пелёнке, но это не отменяет обязательных прогулок с собакой дважды в день. Энергичные питомцы нуждаются в активном времяпрепровождении.

 

Йоркширский терьер белый, шоколадный и другие окрасы, фото

Стандарт йоркширского терьера не допускает никакого другого цвета его шерсти, кроме основного сизо-стального и золотисто-коричневых участков на определенных частях туловища. Причем шерстинки разных оттенков не должны перемешиваться. Но это строгое правило относится только к выставочным собачкам, тогда как многие владельцы домашних любимцев предпочитают совершенно другие цвета шерсти у представителей этой породы. В этой статье мы разберемся, какие окрасы могут иметь эти декоративные собачки.

Основы стандарта

Четкие правила, указанные в стандарте, говорят о том, что у йоркширского терьера должен быть сизо-стальной, без примесей серебряного или голубого, окрас, который простирается от середины шеи — затылочного бугра, до основания хвостика.

Золотисто-коричневый цвет шерсти у собаки этой породы должен находиться на голове, не распространяясь на шею, в районе грудной клетки и на лапах, но не выше локтевых и коленных суставов. Сизо-стальной окрас хвостика йоркширского терьера заметно темнее, чем на корпусе, особенно ближе к кончику.

Стоит отметить, что цвет корней шерстинок у стандартных йорков должен быть темнее, чем цвет кончиков. Данный факт можно объяснить тем, что, по мере отрастания шерстинки становятся все тоньше. Это приводит к разреженности пигментации окраса – осветлению.

В итоге, шерсть йоркширского терьера у основания будет следующей:

• на корпусе – темно сизый;
• на конечностях и груди – темно коричневой.

Отдельно нужно сказать про окрас шерсти на голове животного. В тех районах, где шерсть длиннее, — по бокам, около основания ушек, на мордочке, – цвет более насыщен.

Благодаря такому неравномерному окрашиванию и шелковистой структуре, шерстяной покров у этих собак создает эффектные переливы стального и золотистого окрасов.

Окончательный окрас формируется у йоркширского терьера ближе к двум-трем годам жизни. До этого возраста шерсть животного постепенно меняет свой цвет. Но не у всех щенков этой породы в итоге останется стандартный окрас.

Щенки йоркширского терьера появляются на свет с черным цветом шерсти, на котором в определенных участках есть пятна разных размеров и оттенков – от желто-золотистого до темно-бронзово-золотистого. Подпалины должны находиться в следующих местах:

• на мордочке;
• под хвостиком;
• на задних лапках – снаружи;
• на передних лапках – на внутренней стороне;
• подмышками, немного задевая грудную клетку.

Нижняя часть туловища, нижняя челюсть, нижняя часть горла должны быть бронзового оттенка. Пока щенок маленький, все цвета могут перемешиваться. По мере его взросления шерсть начинает меняться. На голове, на грудной клетке и на лапках шерстяной покров становится золотисто-коричневым. Черный цвет полностью исчезает.

Сизо-стальной окрас появляется там, где он и должен быть у взрослого йоркширского терьера – от затылочного бугра до хвоста, и на самом хвосте цвет немного темнее.

Если щенок появился на свет совершенно черным, бронзовым, серым с большими рыжими, шоколадными или белыми пятнами, у него уже не будет стандартного окраса.

У йоркширского терьера есть своеобразная зависимость между качеством шерстяного покрова и цветом. У животных с очень темным окрасом практически никогда не бывает прямой и качественной шелковистой шерсти. В основном у таких собак шерстинки имеют небольшие волны.

Если у щенка светлый окрас, тогда его шерстяной покров больше приближен к идеальной структуре, но цвет со временем может принять желтоватый оттенок. Черные йоркширские терьеры в основном имеют редкую шерсть, жесткую на ощупь, которая медленно растет и крайне редко достигает земли.

Получение насыщенного сизо-стального окраса – крайне непростая задача для любого заводчика. Но в случае удачи, шерсть йоркширского терьера будет идеальной – шелковистой и блестящей. Это поможет принести собаке высшую оценку на выставке. Конечно, если у нее нет каких-либо дефектов.

Другие оттенки шерсти

На сегодняшний момент у йоркширского терьера существует большое разнообразие окрасов, помимо стандартного. Если вы где-нибудь увидите йорка, например, шоколадного оттенка с белыми подпалинами, значит, это представитель нового подвида породы.

Рассмотрим подробно, какие виды йоркширского терьера набирают популярность.

Один из новых видов был выведен в Германии и называется бивер йорк. У этих собак голова окрашена в три оттенка: белый, черный, золотистый. А корпус может быть либо черно-белым, либо бело-голубым.

В результате мутации из бивер йорков получились биро йорки. Их отличительная черта в окрасе – шоколадный ген, из-за которого черный цвет осветлился до шоколадного.

Также подвидом йоркширского терьера можно назвать такую экзотическую неофициальную породу, как шоколадный йорк – чоко йорк.

У этих собак насыщенный шоколадный оттенок равномерно распределяется по всему туловищу, а носик, коготки и подушечки лап имеют коричневый цвет. Интенсивности такого окраса варьируется от светлого «молочного» шоколадного до темного «горького» шоколадного.

Еще одной разновидностью является довольно редкий голден йорк. У него золотой окрас шерсти различной насыщенности.

Если вы планируете для своего питомца выставочную карьеру, тогда вам нужно учитывать, что данные виды йоркширского терьера на признаны как отдельные породы. Для племенного разведения они также не подойдут, так как нет никакого определенного прогноза, каким будет будущее потомство. А вот в качестве домашнего любимчика такие собачки смогут порадовать любого хозяина.

А какой окрас у собак этой породы нравится вам? Поделитесь с нами в комментариях.

Если статья вам понравилась, поделитесь пожалуйста ею со своими друзьями.

Йоркширский терьер | Описания и фото животных

 14807  14808  14809  14810

Йоркширские терьеры – наверное, самые популярные в мире маленькие собачки. Например, в США они занимают второе место после «национальной» породы — лабрадоров, а в России первое. Йорки умны, спокойны и не капризны, у них нет подшерстка, и они практически не линяют – короче говоря, это идеальные собаки для мегаполиса.

История породы

Родиной йоркширского терьера являются графства Йоркшир и Ланкашир в северной Англии. Его возможными предком называют уотерсайдского терьера. Эта порода была популярна в XVIII—XIX веках в Йоркшире и описывалась как «маленькая, серо-голубая собака с полудлинной шерстью». Этих собак держали крестьяне, так как им было запрещено заводить больших собак, чтобы они не браконьерствовали на землях, принадлежавших знати. Небольшие собачки охраняли дома от грызунов и сопровождали своих хозяев в торговых поездках вдоль рек и каналов (отсюда и название). Некоторые специалисты называют в числе предков йорков и мальтийских болонок, несмотря на то, что внешне они совсем не похожих: у мальтезе висячие уши и белый окрас. Считается, что йорков скрещивали с болонками, чтобы улучшить качество их шерсти, структуру волоса и получить шелковистость. В пользу этой теории говорит то, что у светлых йорков часто очень хорошее качество шерсти.

В конце XVIII века с началом индустриализации многие люди в поисках работы переезжали в города на западе графства, приезжали работники также и из Шотландии. С собой они привозили своих собак, которых в то время называли «шотландскими терьерами», впоследствии среди них были выделены такие породы как пейсли-терьер, клайдесдейл-терьер и скай терьер. В Манчестере также был свой вид терьеров — манчестерский терьер. Заводчикам удалось получить его разновидность с мягкой, длинной и шелковистой шерстью. Вероятно, все эти породы участвовали в выведении йоркширского терьера. Наиболее близки к современному йорку были пейсли-терьер и клайдесдейл-терьер, которые так и не были признаны Кеннел-Клубом как отдельные породы, и со временем их разведение было прекращено.

Выведением новой породы занялись ткачи, работавшие на новых фабриках. Им удалось вывести собаку с длинной шелковистой шерстью голубовато-стального цвета с чистыми золотисто-коричневыми подпалинами. Йорки того времени имели более длинное тело и более крупный размер, чем современные, обычным для них был вес 6-7 кг. Новая порода под названием «йоркширский голубой с подпалинами шелковистошёрстный терьер» быстро завоевала популярность, вытеснив другие разновидности небольших английских терьеров. Позже эта порода приглянулась королевской знати, важным персонам, аристократам и богачам, которые отводили для содержания красивых питомцев целые палаты.

В 1886 году порода была признана Кеннел-Клубом и внесена в племенную книгу. В 1898 году был организован первый клуб йоркширских терьеров. В России первый йорк появился лишь в 1971 году. Он был подарен балерине Ольге Лепешинской.

Внешний вид

Йоркширский терьер — одна из самых маленьких пород собак. Вес йорка не должен превышать 3,1 кг, минимальный вес или рост стандартом не ограничен. Общий вид так описан в стандарте: длинношёрстная собака, шерсть спадает абсолютно прямо и равномерно по бокам, пробор проходит от мочки носа до кончика хвоста. Очень компактная и изящная, осанка подчёркнуто горделивая и важная.

Йоркширский терьер — длинношёрстная порода и не имеет подшерстка. Это значит, что они практически не линяют. Их шерсть похожа на волосы человека в том, что она постоянно растёт и редко выпадает (только при расчёсывании или повреждении). Благодаря структуре своей шерсти йорки реже вызывают у людей аллергию.

Шерсть на голове длинная, ниспадающая сочного золотистого красно-коричневого цвета; при этом окрас интенсивнее по бокам головы, у основания ушей и на морде, где шерсть наиболее длинная. Красно-коричневый окрас головы не должен распространяться на шею, не должен иметь примеси волос серого или чёрного цвета.

Окрас у йорка тёмный голубовато-стальной, не допускается примеси желтовато-коричневых, бронзовых или тёмных волос. Шерсть на груди интенсивного ярко красно-коричневого окраса. Все красно-коричневые волосы у корней темнее, чем в середине и к концам становятся ещё светлее. Конечности собаки хорошо покрыты шерстью золотистого красно-коричневого окраса. При этом концы волос оттенены более светло, чем корни. Красно-коричневый цвет не должен быть выше локтей и колен. Уши покрыты короткой шерстью очень сочного красно-коричневого цвета. Хвост обильно покрыт шерстью голубого цвета, более тёмного оттенка, чем на корпусе, в особенности на конце хвоста.

Характер

Несмотря на миниатюрность, йоркширский терьер сохраняет качества, присущие терьерам больших размеров — смелость, любопытство, неутомимость. Он доброжелателен и с людьми, и с другими собаками и предан хозяину.

Йоркширские терьеры больше чем собаки какой-либо другой породы нуждаются во внимании. Они готовы весь день проводить рядом с хозяином — на руках или следуя за ним по пятам; с удовольствием бегают, прыгают, играют в мяч, «охотятся» на птиц, мышей или солнечных зайчиков, при этом не забывая следить за реакцией хозяина. Йоркширские терьеры настойчиво добиваются своего, будь то внимание хозяина или порция еды. Они хорошо чувствуют настроение хозяина и подстраиваются под него.

Охотничий азарт йоркширского терьера иногда представляет для него опасность: в загородных посёлках йорки ловят и поедают жуков, а также раненых мышей, если их уронит хищная птица.

Любящие и преданные, смелые и уверенные в себе они подходят для содержания как опытным так и не опытным владельцам. Эти живые и любознательные собачки — прекрасные компаньоны. Йоркширские терьеры очень умны, но иногда, их не очень легко обучать в виду независимости характера. Хитрые и настойчивые собачки способны добиваться своих целей и при этом искусно манипулировать хозяином. Несмотря на свои маленькие размеры, мужественные и независимые йоркширы, часто пытаются доминировать над другими собаками, как бы пренебрегая их статусом. С другими животными в доме они хорошо уживаются.

Эту породу собак можно содержать с детьми, которые очень нежно будут обращаться с этой собачкой и уже понимают, что такому хрупкому животному можно легко нанести увечье.

Установите границы дозволенного, и йорк будет прекрасным компаньоном, но если вы избаловали его – берегитесь! Начинайте дрессировку со щенячьего возраста, и это даст гораздо лучший результат, чем если вы будете все позволять любимцу, а затем начнете бороться с появившимися у малыша вредными привычками. Как и другим собакам, йоркам нужна ранняя социализация – со щенячьего возраста их нужно знакомить с разными людьми, звуками, видами деятельности. Социализация способствует превращению щенка в дружелюбную, развитую собаку.

Содержание

Благодаря небольшому размеру йорка легко содержать в городе, даже в небольшой квартире. Его можно приучить к «кошачьему» лотку или специальной пелёнке в качестве туалета, что снимает проблему обязательных прогулок. Однако совсем отказываться от прогулок не стоит, поскольку они доставляют йорку большое удовольствие, к тому же, ему необходима двигательная активность. Зимой его одевают, чтобы снег не набивался в шерсть, и собака не мёрзла. Йорка легко взять с собой в любую поездку в сумке-переноске. Но необходимо учитывать, что собака таких размеров достаточно хрупка и её можно травмировать, например, наступив. Особенно аккуратно нужно обращаться с щенками, щенок йорка не подходит для семей с маленькими детьми, так как ребёнок может уронить его или слишком сильно сжать.

Место для собаки выбирается так, чтобы в нем не было сквозняков. Немаловажным является также то, насколько оно уютное и сильно ли удалено от места отдыха домочадцев. Йоркширские терьеры не любят одиночества и своре всего не станут долго находиться там, где они не могут быть в курсе всех происходящих в доме событий. Лучше, если находиться лежанка собаки будет на возвышении. Это поможет решить большинство проблем и сами собаки с удовольствием наблюдают за жизнью в доме с дивана или хозяйской кровати.

Наибольшую сложность представляет уход за шерстью йорка, если она остаётся длинной. Такую собаку необходимо регулярно мыть с шампунем и бальзамом, а также смазывать шерсть маслом. Если собака не участвует в выставках, её обычно подстригают довольно коротко. Существуют различные модели стрижек, которые можно выполнить в домашних условиях или обратившись к специалисту. В целях гигиены полностью состригают шерсть на нижней поверхности хвоста, под ним, в нижней части живота. В других местах шерсть может оставляться более или менее длинной. Стрижку нужно повторять раз в 2-3 месяца.

Глаза йорка необходимо протирать каждый день ватным тампоном, смоченным водой, для удаления глазных выделений, которые, смешиваясь с пылью, могут вызвать конъюнктивит. При этом нужно также расчёсывать шерсть на мордочке, чтобы она не попадала в глаза.

Зубы необходимо чистить для удаления налёта и камней. Можно чистить зубы специальной щёткой, давать собаке жевательные «косточки», при образовании заметных зубных отложений рекомендуется отвести собаку к ветеринару. Если когти у собаки не стачиваются сами во время прогулок (если собака мало гуляет или не гуляет вообще), их необходимо подстригать.

Владельцы йоркширских терьеров наверняка слышали, какие забавные звуки издают их питомцы. Эти собаки зачастую как будто хрюкают, удивляя или даже пугая этим своих хозяев. Подобные звуки являются характерной особенностью породы и довольно легко объяснимы. На самом деле эти хрюкающие звуки называются обратным чиханьем. Вместо того чтобы выдыхать воздух, как происходит при обычном чиханье, йоркширские терьеры, вдохнув какой-то раздражитель (пыльцу или пыль), совершают несколько резких вдохов, которые сопровождаются странными звуками. Обратное чиханье не представляет опасности для собаки и проходит само по себе в течение нескольких минут.

Йорки обладают достаточно крепким здоровьем. Средняя продолжительность их жизни составляет 12-15 лет, отдельные особи достигают возраста более 20 лет.

Йоркширский терьер (Yorkshire Terrier) – фото, описание породы, стрижка и одежда, отзывы владельцев

История возникновения йоркширского терьера началась во времена промышленной революции в Англии, когда шотландские рабочие привезли с собой небольших собак, которых в те времена называли пейсли терьер либо клайдсдейл терьер. Рабочие в те далекие времена жили в крайне неблагоприятных условиях, и крыс в их более чем скромных домах, водилось немыслимое количество, собственно, собак выбрали именно для борьбы с грызунами.

Разумеется, те собаки были почти вдвое больше современных йоркширских терьеров. Сегодня исследователи не могут точно сказать, с какими собаками скрещивали пейсли терьеров, но предполагают что это были английский черно-подпалый той-терьер, скай терьер, а также, вполне возможно, уотерсайд терьер. В любом случае, впоследствии получилась собака, которая очень напоминала нынешнего йоркширского терьера, и с тех пор практически не изменилась.

Этот пёс уже мало подходил для отлова крыс, так как был совсем небольших размеров, однако, после показа на так называемом бенч-шоу в 1861 году, он стал обретать популярность среди аристократии. Это и неудивительно — милый характер, привлекательная внешность, нестандартная шерсть которая может отрасти очень длинной, и дает большой простор для фантазии собачьего парикмахера (грумера) — все это моментально приковывало к себе внимание.

Впрочем, тогда их ещё не называли йоркширский терьер. Название появилось девятью годами позже, в 1870. Больше всего порода развивалась в Йоркшире, а потому и получила соответствующее название. Собака Хаддерсфилд Бен 1865 года рождения считается родоначальником породы.

В племенной книге Британского Кеннел Клуба йоркширский терьер был зарегистрирован впервые в 1874 году, а первый клуб этих собак в Англии появился в 1898 году. Первое упоминание о рождении собаки данной породы в США датируется 1872 годом, а участие в выставках на территории Америки началось в 1878 году. На сегодняшний день, это одна из наиболее популярных пород декоративных собак в США и Европе, причем, страны СНГ — не исключение.

характеристики, фото, рекомендации по уходу и выбору корма

Йоркширский терьер – четвероногая игрушка и лучший друг детей, лохматый источник неиссякаемой энергии и интеллектуальный компаньон. Как ни назови этого декоративного любимца, он не перестаёт удивлять, и пусть вас не обманывает его кукольная внешность.

Кратко о породе

• Название породы: Йоркширский терьер
• Страна происхождения: Великобритания
• Вес: 2-6 кг
• Рост (высота в холке): 18-20 см
• Продолжительность жизни: 14–16 лет
• Группа породы по МКФ: терьеры
• Размер: маленький

Характер йоркширского терьера

Как только вы решили завести в доме это мохнатое миниатюрное чудо, придётся запомнить несколько важных моментов, касающихся поведения:

• Они славятся плохой усидчивостью, независимо от степени ежедневной нагрузки и продолжительности прогулок. Если нужно подолгу сидеть дома с человеком, не пройдёт и часа, как любимец напомнит о себе, требуя максимального внимания.
• Малый размер – не повод забывать о «звериной» натуре. Рано или поздно любой йорк захочет проверить, «кто в доме хозяин», и как только подобное поведение выходит за рамки игры, нужно задуматься о более строгих мерах воспитания.
• Девочки этой породы более спокойные и не такие капризные, как мальчики. Особенно это заметно во время визитов к ветеринару и посещения груминг-салонов. Порой даже причесать мужчину йоркшира бывает сложно из-за поднятого лая.
• Когда собака трясётся – ей действительно холодно, и нужно позаботиться о тёплом укромном местечке. Генетическая проблема породы – плохая переносимость зимних холодов и межсезонья, что актуально в суровом российском климате.
• Перегрызенные провода и испорченная обувь – прямой результат недосмотра в щенячьем возрасте. Пёс может периодически хулиганить, но в любом случае должен понимать, что хозяину это вряд ли понравится, и последует неминуемое наказание.
• С детьми йорки ладят, любое проявление агрессии – крайняя редкость, чаще всего – в ответ на слишком крепкие объятия. Для пожилых людей такая собака станет отдушиной и ежедневным зарядом позитива.

История породы

Как и с другими европейскими породами, предки йоркширов не имеют ничего общего с одноимённым графством, там они были лишь выведены. В качестве основы для селекции в первой половине XIX века были взяты несколько шотландских собак, привезённых рабочими с северных областей. Ими стали пейсли, клайдесдейл и скай-терьеры, отличавшиеся небольшими размерами, хорошей выносливостью «в поле» и густой шелковистой шерстью.

Второе заблуждение касается предназначения умилительных собачек. Изначально их не задумывали как декоративную породу, забавные с виду малыши должны были выполнять вполне реальную работу – ловить мелких грызунов и насекомых-паразитов, долгое время досаждавших английским фермерам в период посевной. И только обратившие на неугомонный комок шерсти британские аристократы решили в корне изменить ситуацию.

Принято считать, что переломным моментом на пути к окончательному одомашниванию фермерских помощников стало добавление в их геном мальтийской болонки, которых очень любили благородные английские леди. Впервые на выставке породу представили в 1861-м году, и тогда она называлась «лохматый шотландский терьер», и лишь спустя 13 лет появилось привычное имя с отсылкой к графству Йоркшир, где их впервые вывели.

В официальный реестр клуба Кеннел породу внесли в 1886-м, а через 12 лет был опубликован долгожданный стандарт внешности, который и сегодня считается строгой догмой. В США первые малыши попали примерно тогда же, став идеальным питомцем для городских квартир зарождавшихся мегаполисов. Знаковым стал и 1985-й, когда столетие спустя после громкого дебюта, совместно с германскими заводчиками вывели смежную породу – бивер-терьера.

Сегодня купить йоркшира может любой желающий, независимо от страны проживания. По последним данным Американского Клуба Собаководов, неугомонные британцы занимают второе место в рейтинге самых востребованных городских собак, уступая лишь другому малышу – немецкому шпицу. В России йоркширский терьер стал популярен среди публичных персон и тех, кому важен не размер, а компанейская уживчивость и активность четвероногого друга.

Особенности породы

Йорки – одна из немногих пород в мире, сумевшая сохранить свой стандарт внешности практически в неизменном виде на протяжении 150 лет.

Внешность

• Реестр МФК – группа 3, секция 4 (тойтерьеры).
• Рост в холке – до 20 см.
• Масса – до 3 кг.
• Окрас шерсти – жёлто-коричневые тона с генетическими вариациями от глубокого чёрного и палевого до светло-серебристого. Шерсть длинная и шелковистая
• Хвост – обязательное купирование в щенячьем возрасте, если планируются участия в выставках. Остальным разрешено оставлять длинный.

Внешне йоркшир – миниатюрная декоративная собачка, которая густо покрыта шерстью, имеет аккуратные прямые лапки и мордочку с так называемым «бэйби-фейсом», она лишь слегка меняется с возрастом. Структура волосяного покрова схожа с человеческой, у них нет подшёрстка, что исключает сильную линьку и снижает риск аллергии у хозяев.

Здоровье и болезни

Как и ряд других тойтерьеров, йоркширские терьеры склонны к ряду генетических заболеваний и проблем, связанных с неправильным питанием. Живущая в хороших условиях собака болеет редко, но это не делает её неуязвимой к внешним угрозам и наследственным проблемам.

По мнению ветеринаров, наибольший риск представляют следующие болезни:

• Диабет, особенно в щенячьем возрасте. Чаще всего проявляется низким уровнем сахара в крови, что сказывается на неврологических проявлениях.
• Онкология – наиболее частая причина смерти возрастных собак.
• Нейродермит – повышенный зуд на фоне стрессовых ситуациях, дискомфорта или как проявление аллергии на неправильно подобранный корм.
• Слабый ЖКТ и затрудненное пищеварение.

На фоне всех рисков йорка рекомендуется отводить на плановый осмотр у ветеринара раз в 3-4 месяца, тогда пёс будет защищён от любых осложнений и проживёт до 13-15 лет.

Воспитание и дрессировка

Несмотря на расхожее мнение, дрессировать йоркширского терьера можно и даже нужно, чтобы маленький питомец реже показывал «характер», особенно при встрече с незнакомыми людьми. Интеллект пса выше среднего, и кажущаяся игривость не должна смущать хозяев.

Ключевые моменты воспитания йорка:

• Они очень пугливы на резкие шумы в доме, в частности – когда вокруг много работающей бытовой техники. К ней питомцу нужно привыкнуть постепенно – не включайте резкую музыку на полную громкость и дайте освоиться со страшным пылесосом.
• Если решили приучать собаку к лотку, придётся подобрать подходящий наполнитель, чтобы каждый поход в туалет не превращался в рытьё «подкопа». Впрочем, это спорное решение, всё же йоркширы предпочитают уличные выгулы.
• На улице первое время понадобится короткий поводок – неугомонный нрав может доставить реальные проблемы, особенно с птицами и бездомными животными по соседству. Следите, чтобы питомец не подбирал мусор, сочтя его игрушкой.

Подробнее о том, как подобрать амуницию для собаки, читайте тут

• Взрослые йорки за пару месяцев способны приучиться к режиму. Выберите дни недели, когда больше уделяется внимания тренировкам, а когда – игре. Хозяин сам не заметит, как четвероногий компаньон начнёт напоминать ему о занятиях.
• Шкодливость терьеров может проявляться даже в глубокой старости, поэтому заранее придётся прятать провода от электроники и дорогостоящие вещи. На любую шалость нужно реагировать немедленно и только голосом, физические наказания лишь усугубят.
• Социализация йоркшира – лотерея. Отдельные псы прекрасно отзываются на внимание членов семьи, другие выберут себе любимчика, а остальных будут опасаться. Важно постоянно демонстрировать собаке своё дружелюбие и любовь, главное – без перегибов.

Рекомендуемый уход

Те, кто говорит, что йоркшир – самая проблемная в плане ухода порода, отчасти правы, потому что поддержание питомца зачастую хлопотно и включает в себя множество нюансов:

• Лохматость не спасает псов от мороза – отсутствие подшёрстка играет ключевую роль, поэтому на холодное время года необходим специальный собачий комбинезон.
• Ухаживать за шерстью нужно в несколько этапов – расчёсывание особыми щётками, мытьё с шампунем раз в 3-4 дня, а также создание причёсок, чтобы облегчить зрительный обзор. К сожалению, не все представители породы с радостью согласны на купание.
• Тем, кто часто передвигается на машине, стоит задуматься о покупке автомобильной подстилки или гамака для собаки. Так решается вопрос чрезмерной активности и безопасности во время движения по оживлённым дорогам.
• Чистить зубы йоркам желательно еженедельно, или чаще, если так предписал ветеринар. Помимо пасты потребуются мягкие ватные палочки.

Рекомендуемые корма

Кормить йоркширского терьера нужно с учётом всех особенностей породы и характера. Они могут запросто отказаться даже от любимого лакомства, если нет настроения. Кроме того, требуется тщательный подбор в случаях, когда у собаки чувствительный кишечник.

Оптимальными сочетаниями станут:

Основные моменты

Обобщая сказанное, можно выделить несколько ключевых моментов о породе:

• Йоркширский терьер – идеальная собака для проживания в компактной квартире, но только если его воспитанием непрерывно занимаются со щенячьего возраста.
• Они бывают чрезмерно активны, постоянно требуют внимания, периодически показывают характер, чтобы хозяин считался с их присутствием в доме.
• Дрессировать йорка реально, хоть на это уйдёт немало времени.
• У йоркширов чувствительный ЖКТ, нужно ответственно подойти к выбору корма.
• Если в доме живёт несколько человек, собака сама выберет, кого будет слушаться.
• За шерстью придётся ухаживать регулярно, если вы не хотите, чтобы ваш четвероногий друг превратился в бесформенную копну волос.
• Маленькие дети влюбятся в йорка с первого взгляда, он в них тоже, но чуть позднее.

Рекомендуем также

Оптимизация MEK с возможностью переключения | PNAS

Значение

Контроль доступа к активным сайтам киназ с помощью фотодимеризуемых доменов революционизирует типы возможных оптогенетических нарушений клеточной сигнализации. Однако эта технология полезна только при наличии сильной киназной активности, которую необходимо использовать. Мы сообщаем о стратегии систематического улучшения и настройки функциональности киназы, активирующей путь внеклеточной сигнально-регулируемой киназы (ERK), MEK, с использованием точечных мутаций с усилением функции, которые дестабилизируют MEK.Фотопереключение активности мутантного MEK путем обратимого связывания его активного сайта контролирует большой динамический диапазон передачи сигналов ERK in vivo. Наш подход к оптимизации и настройке активируемых светом протеинкиназ не ограничивается MEK и может использоваться для систематического расширения возможностей активируемых светом регуляторных ферментов.

Abstract

Оптогенетические подходы меняют количественные исследования сигнальных систем клетки. Недавно разработанный фотопереключаемый фермент митоген-активируемой протеинкиназы 1 (MEK1) (psMEK) замыкает высококонсервативный сигнальный каскад внеклеточной сигнальной киназы (ERK) на самом проксимальном этапе активации эффекторной киназы.Однако, поскольку этот оптогенетический инструмент основан на заменах, имитирующих фосфорилирование, в петле активации MEK, его каталитическая активность, как предполагается, будет значительно ниже, чем у MEK дикого типа, фосфорилированного по этим остаткам. Здесь мы представляем доказательства того, что psMEK действительно обладает субоптимальной функциональностью in vivo, и предлагаем стратегию обхода этого ограничения путем использования дестабилизирующих мутаций в MEK, вызывающих усиление функции. В частности, мы демонстрируем, что сочетание фосфомиметических мутаций с дополнительными мутациями в MEK, выбранными по их активирующему потенциалу, восстанавливает максимальную активность киназы in vitro.Мы установили, что эта модификация может быть настроена путем выбора дестабилизирующей мутации и не мешает обратимой активации psMEK in vivo как у Drosophila , так и у рыбок данио. Чтобы проиллюстрировать типы возмущений, обеспечиваемые оптимизированным psMEK, мы используем его для доставки импульсов активации ERK во время эмбриогенеза рыбок данио, выявляя реостатные ответы ERK-зависимого морфогенетического события.

Большая часть нашего нынешнего понимания сигнальных сетей опирается на однородные генетические пертурбации с использованием мутаций с усилением или потерей функции, которые в целом нарушают передачу сигналов.Тем не менее, сигнальные пути повторно используются во многих различных контекстах, которые требуют диапазона доз, продолжительности и динамики (1). С помощью оптогенетики мы можем генерировать пространственно-временные паттерны передачи сигналов, которые почти так же точны, как наши измерения индуцированных молекулярных и клеточных ответов (2, 3). В частности, световые механизмы для контроля передачи сигналов через высококонсервативный путь внеклеточной сигнально-регулируемой киназы (ERK) начали выявлять важные количественные характеристики сигнальных систем клеток, такие как динамическое кодирование информации и временный контроль ответов судьбы в дифференцирующихся тканях. (4⇓ – 6).

На сегодняшний день большинство инструментов передачи сигналов opto-ERK активируют передачу сигнала посредством димеризации рецептора или транслокации компонентов пути, проксимального к рецептору, к плазматической мембране (7⇓⇓ – 10). Эти оптогенетические системы имитируют предшествующие этапы активации и поэтому идеальны для исследований, анализирующих количественные характеристики нижележащего сигнального каскада (11). С помощью этих инструментов мы можем назначать лигандоподобные входы в путь с помощью света и использовать активность эффекторной молекулы ERK в качестве выхода (12).Однако для изучения того, как конечная активация ERK контролирует последующие реакции, такие как индукция целевого гена, было бы идеально доставлять оптогенетические входные данные как можно ближе к ERK, чтобы минимизировать нецелевые эффекты и потенциально затрудняющие механизмы обратной связи, действующие в пределах каскад передачи сигнала в восходящем направлении (1, 13, 14). Разработка оптогенетических инструментов, которые работают на проксимальных этапах фосфорилирования и активации ERK, поэтому является важной целью для изучения последствий активации пути.

Альтернативные стратегии для более прямой активации ERK стали возможными благодаря недавней разработке светопереключаемых вариантов киназы ERK, митоген-активируемой протеинкиназы киназы 1 (MEK1) (15, 16). В фотосопереключаемой форме MEK1 (обозначенной как psMEK1tight) один домен сконструированной фотодимеризуемой Dronpa (pdDronpa) был слит после N-концевого сайта стыковки субстрата (аминокислоты от 1 до 60), а другой — в гибкой области MEK1, называемой петля FG (перед аминокислотой 305) (15, 16).Домены pdDronpa вставлены в эти положения, так что они могут обратимо блокировать активный сайт MEK, когда фермент находится в своей активной конформации. Поскольку эта конструкция является одноцепочечной, внутренняя активность MEK определяет оптогенетическую входную силу. Обычно киназа RAF фосфорилирует 2 остатка серина в активационной петле (S218, S222) MEK, чтобы способствовать конформационному изменению, которое позволяет ERK получить доступ к активному сайту MEK (17, 18) (рис. 1 A ). Мутации из серина в аспарагиновую кислоту (S> D) были сделаны в активационной петле psMEK1tight (здесь обозначается как psMEK), чтобы имитировать присутствие фосфатных групп и конститутивно активировать фермент независимо от RAF (15, 19, 20) (рис. .1 В ). Конститутивная активность psMEK подавляется, когда свет 400 нм индуцирует димеризацию pdDronpa, которая образует физический барьер между MEK и ERK. Свет в пятьсот нанометров диссоциирует домены pdDronpa и восстанавливает функцию psMEK.

Рис. 1. Эффекты

псМЕК in vivo. ( A ) RAF фосфорилирует 2 остатка серина (красный, S218 и S222) в петле активации MEK. Когда MEK не фосфорилирован, предпочтительна его неактивная конформация, что показано большей стрелкой, направленной влево.Когда RAF фосфорилирует MEK, активная конформация является предпочтительной. ( B ) psMEK содержит мутации S> D в петле активации, которые имитируют эффекты фосфорилирования RAF. Фосфомиметические замены поддерживают psMEK в активной конформации. Постоянно активный psMEK контролируется фотопереключаемыми доменами Dronpa (зеленый), которые блокируют активный центр при димеризации (в свете 400 нм) и открывают активный центр при диссоциации (в свете 500 нм). ( C ) ERK активен только (dpERK) на полюсах в 3-часовом эмбрионе Drosophila .Эктопическая передача сигналов ERK в середине эмбриона нарушает формирование зубчатых поясов у личинок и приводит к летальному исходу (> 36 ч. F.). Эмбрионы, экспрессирующие psMEK (черные полосы), проявляли значительную летальность при воздействии света 500 нм. Освещение 400 нм не было летальным. Длина волны освещения не влияла на летальность контрольных эмбрионов дикого типа (серые столбцы). Планки погрешностей представляют собой средние и стандартные отклонения для 3 повторов. Объединенные числа N следующие: N _{OreR, 400 нм} = 291, N _{OreR, 500 нм} = 543, N _{psMEK, 400 нм} = 1166, N _{psMEK, 500 нм} = 2,179, N _{psMEK, темный} = 621, и N _{psMEK, комната светлый} = 607.( D ) У эмбрионов рыбок данио ERK эндогенно активен в крае бластодермы на скорости ~ 6 л.с. Передача сигналов ERK в немаргинальных клетках вызывает дефектные морфогенетические движения, которые удлиняют эмбрион, измеряемое как соотношение сторон (большая ось «a» / малая ось «b») желтка на стадии хвостовой почки (10 h.p.f.). Эмбрионы, экспрессирующие psMEK посредством инъекции мРНК (черные полосы), не показывают значительного увеличения соотношения сторон, зависящего от длины волны. Неинъектированные эмбрионы (серые столбцы) оставались сферическими как в свете 400, так и в 500 нм.Желтая линия представляет максимальное соотношение сторон, указанное в SI Приложение , рис. S2 и исх. 28. Общее количество измеренных эмбрионов выглядит следующим образом: N _{psMEK, 400 нм} =, 112 N _{psMEK, 500 нм} = 112, N _{не введено, 400 нм} = 114, и N _{не введено, 500 нм} = 97. В C и D , * P <0,05.

Здесь мы показываем, что psMEK активирует ERK только слабо in vivo, основываясь на его светозависимых дефектах развития у Drosophila и эмбрионов рыбок данио.Хотя эти противоречивые фенотипические эффекты можно объяснить различными уровнями экспрессии, различной чувствительностью к активным уровням ERK или даже дифференциальным связыванием с видоспецифичными гомологами ERK, мы обнаружили, что стратегия активации MEK с использованием мутаций, имитирующих фосфорилирование S> D, является подходящей. внутренне неоптимальный дизайн. Мы характеризуем скорость фосфорилирования ERK с помощью MEK и демонстрируем, что фосфомиметические мутации не могут повторять активность фосфорилированной MEK (15).

Мы предположили, что активность psMEK может быть значительно усилена за счет использования дестабилизирующих мутаций увеличения функции в MEK (20).Мы установили, что эта стратегия работает как in vitro, используя измерения MEK-зависимой кинетики активации ERK, так и in vivo, нарушая ERK-зависимые онтогенетические события у Drosophila и рыбок данио. Важно отметить, что наша стратегия повышения активности psMEK может быть настроена путем выбора дестабилизирующей мутации и не ставит под угрозу обратимость и скорость индуцированной светом активации. Наконец, мы реализуем наш оптимизированный psMEK для доставки импульсов активности ERK с высокой амплитудой в ранний эмбрион рыбок данио, выявляя зависящие от продолжительности особенности восприятия ERK, которые выходят за пределы динамического диапазона исходного psMEK.

Результаты

Фенотипические эффекты псМЕК.

Мы впервые проанализировали функцию psMEK у ранних эмбрионов Drosophila , где передача сигналов ERK обычно ограничивается передним и задним полюсами, чтобы формировать будущие структуры головы и хвоста (21). Даже небольшое повышение уровня сигнала выше базального в середине эмбриона является летальным. Эта эктопическая активность ERK вызывает аберрантную экспрессию строго регулируемых генов gap, которые имеют решающее значение для образования 8 полных сегментов в кутикуле личинки (22).

Эмбрионы Drosophila , экспрессирующие psMEK и подвергнутые воздействию света 500 нм, показали значительную летальность по сравнению с освещением 400 нм (фиг. 1 C ). Кутикула личинок мертвых эмбрионов, подвергшихся воздействию активирующего света, в основном разрушалась, указывая на максимальное нарушение регуляции передачи сигналов ERK ( SI Приложение , Fig. S1). Распределение фенотипов кутикулы, которое мы наблюдали, сходно с распределением мутантов с сильным усилением функции, влияющих на путь ERK и активацию с помощью чувствительной к синему свету системы optoSOS (7, 23).

Мы использовали морфологические дефекты у ранних эмбрионов рыбок данио в качестве показателя индуцированной светом активности ERK во втором контексте in vivo. Конститутивная передача сигналов ERK у эмбрионов рыбок данио приводит к аномальным движениям конвергенции и разгибания, которые вызывают дозозависимое растяжение обычно сферического желтка вдоль передне-задней оси. В результате получается удлиненный эмбрион (называемый фенотипом «овального эмбриона»), который можно количественно оценить по соотношению сторон желтка (Рис. 1 D ) (24⇓⇓ – 27).Эти морфологические данные отражают силу эктопической активации ERK и используются для ранжирования степени тяжести мутаций MEK, связанных с заболеваниями человека (28).

Неожиданно мы обнаружили, что светоактивированный psMEK не индуцирует фенотип овального эмбриона, как ожидалось. Мы измерили небольшое увеличение соотношения сторон для эмбрионов, экспрессирующих psMEK (~ 1,05), по сравнению с контрольными эмбрионами дикого типа (WT) (~ 1), которое не зависело от длины волны света (рис. 1 D ). Более того, эти эффекты представляют собой часть диапазона возможных фенотипов: соотношение сторон приближается к 1.5 были измерены в случаях сильной эктопической активации ERK (28). Сверхэкспрессия фосфомиметической MEK (непереключаемой) также демонстрирует меньшую элонгацию по сравнению со сверхэкспрессией более сильных вариантов MEK, таких как тот, который содержит мутацию рака E203K. Это говорит о том, что фосфомиметические замены активируют лишь слабо и, следовательно, ограничивают применимость psMEK только к наиболее чувствительным контекстам развития, таким как ранний эмбрион Drosophila ( SI Приложение , рис.S2).

Дестабилизирующие мутации повышают активность фосфомиметических МЭК.

Мы предположили, что стратегия активации, использующая фосфомиметические мутации, может внутренне ограничивать функцию psMEK, потому что аспарагиновые кислоты (D) не полностью воспроизводят сильно отрицательно заряженное химическое окружение фосфатных групп внутри MEK (29, 30). Чтобы улучшить psMEK, мы обратились к идее объединения фосфомиметических замен с активирующими мутациями, идентифицированными по их роли в заболеваниях человека, вызванных аномально высокой передачей сигналов ERK, включая RASопатии и рак (рис.2 А ). Миссенс-мутации, дестабилизирующие MEK и вызывающие конститутивную активность, были обнаружены у пациентов с некоторыми из этих заболеваний (20, 31). Мы пришли к выводу, что добавление этих мутаций к фосфомиметическому домену MEK в psMEK повысит киназную активность при сохранении независимости от вышестоящих активаторов и обеспечении полностью ортогонального оптогенетического входа ERK. Мы решили использовать замену E203K, обнаруженную при раке, для усиления киназной активности, поскольку она находится на вершине списка патогенных мутаций, ранжированных по их влиянию на удлинение желтка рыбок данио (28).Эта замена нарушает важное взаимодействие, которое, как известно, стабилизирует область молекулы MEK, которая подавляет ферментативную активность (31). В соответствии с этими дестабилизирующими эффектами мы обнаружили, что замена E203K снижает термическую стабильность MEK (как фосфорилированной, так и нефосфорилированной) ( SI, приложение , рис. S3). Кроме того, моделирование молекулярной динамики показывает, что вариант E203K входит в конформации, которые сильно отличаются от конформаций нефосфорилированной MEK дикого типа, что также указывает на дестабилизацию (31).Такое поведение аналогично целому классу мутаций болезни с диапазоном силы активации и делает замену E203K хорошим кандидатом для проверки нашей гипотезы по оптимизации psMEK (20).

Активная MEK фосфорилирует ERK по тирозину и треонину, чтобы активировать ее (рис. 2 B ) (32⇓ – 34). Сначала мы измерили кинетику, с которой монофосфорилированная и дважды фосфорилированная (dp, активная) формы ERK появляются в присутствии MEK с S218D и S222D (обозначаемые как MEK ^DD ), дважды фосфорилированной MEK (dpMEK) или фосфомиметической MEK. с заменой E203K (MEK ^{DD, E203K} ) in vitro.MEK ^DD фосфорилировал ERK очень медленно по сравнению с dpMEK, подтверждая, что конститутивная активность молекулы фосфомиметика действительно субоптимальна (рис. 2 C — E ). Напротив, MEK ^{DD, E203K} продемонстрировали резкое увеличение скорости фосфорилирования ERK, даже превышающее скорость, наблюдаемую для dpMEK (фиг. 2 C — E ). Таким образом, MEK ^{DD, E203K} более активны, чем dpMEK, но не могут быть дефосфорилированы и инактивированы.Основываясь на этих результатах, демонстрирующих, что дестабилизирующие мутации могут значительно увеличивать активность фосфомиметической MEK in vitro, мы приступили к тестированию, может ли мутация E203K усиливать активность psMEK in vivo.

Рис. 2.

Повышение активности МЕК дестабилизирующими мутациями. ( A ) Фосфомиметический MEK (MEK ^DD ), по прогнозам, будет значительно менее активен, чем dpMEK. Дестабилизация MEK ^DD с помощью дистальной замены E203K (синий) создает другой вариант MEK (MEK ^{DD, E203K} ), который, по нашим прогнозам, будет проявлять повышенную активность.( B ) Активный MEK катализирует двойное фосфорилирование ERK. ( C ) Данные анализов киназы in vitro, показывающие кинетику уровней нефосфорилированных ERK (np-ERK) в присутствии фосфомиметика (фиолетовый, MEK ^DD ), фосфорилированного (голубой, dpMEK) и фосфомиметика MEK с E203K ( темно-красный, MEK ^{DD, E203K} ). Данные основаны на n = 5 для MEK ^DD и dpMEK и n = 6 для MEK ^{DD, E203K} во все моменты времени. ( D ) Динамика уровней монофосфорилированного ERK (pY-ERK) для 3 различных вариантов MEK.( E ) Динамика уровней дважды фосфорилированного ERK (dpERK, pTpY-ERK) для 3 различных вариантов MEK. ( F ) Количественная оценка конфокальных изображений иммунофлуоресцентного окрашивания для dpERK у 3-часовых эмбрионов Drosophila . Интенсивности dpERK в середине эмбриона (50% длины эмбриона) представлены для WT и psMEK-экспрессирующих эмбрионов, активированных светом 500 нм. Все измерения отражают уровни dpERK, нормализованные к максимальной интенсивности dpERK в контрольных эмбрионах WT (на переднем полюсе).Пунктирная линия, проведенная при 1,0, представляет максимальную интенсивность dpERK у эмбрионов WT. N _WT = 17 и N _psMEK = 25. ( G ) Те же количественные оценки, которые описаны для эмбрионов, экспрессирующих psMEK с дополнительной мутацией E203K, обозначены как psMEK ^E203K . N _WT = 18 и N _psMEKE203K = 15. В F и G , * P <0,05.

Дестабилизирующие мутации усиливают функцию psMEK in vivo.

Затем мы сконструировали трансгенных мух, экспрессирующих psMEK, который уже содержит фосфомиметические мутации, а также psMEK с дополнительной мутацией E203K (здесь обозначается как psMEK ^E203K ) в раннем эмбрионе.Для этих экспериментов эмбрионы освещали светом 500 нм, чтобы освободить домены Dronpa и обнажить активный сайт MEK. Мы провели иммунофлуоресцентное окрашивание для дважды фосфорилированной ERK (dpERK) и количественно определили уровни активной ERK в средней области эмбриона, где присутствуют все компоненты пути ERK, но этот путь не активируется внеклеточными сигналами (21). В соответствии со значительным увеличением ферментативной активности, наблюдаемым in vitro, мы обнаружили, что активация ERK, основанная на уровнях dpERK, вызванных активированным psMEK ^E203K , значительно сильнее, чем dpERK, индуцированная psMEK.По сравнению с эндогенными количествами dpERK на полюсах эмбриона, где ERK активируется посредством локальной передачи сигналов рецепторной тирозинкиназы, активация psMEK индуцировала более низкие уровни dpERK, а активация psMEK ^E203K вызывала более высокие уровни dpERK (рис. 2 F и ). G ). Это наблюдение согласуется с нашими результатами анализов киназ in vitro, показывающими иерархию активности от MEK ^DD до dpMEK, до MEK ^{DD, E203K} . Таким образом, замена E203K также гиперактивирует psMEK in vivo.

Затем мы спросили, дает ли оптимизированный psMEK утечку активации ERK в клеточной конформации при освещении светом 400 нм. Мы рассмотрели этот вопрос на эмбрионах рыбок данио, у которых протекающая активность инструмента передачи сигналов optoSOS вносит вклад в сокращение динамического диапазона ERK-зависимых дефектов ( SI Приложение , Fig. S4). Мы измерили уровни dpERK у эмбрионов, экспрессирующих исходную конструкцию psMEK, при 50% эпиболии [~ 6 часов после оплодотворения (h.p.f.)], стадии, когда активация эндогенной ERK ограничена эмбриональным краем (23, 35, 36).У эмбрионов, освещенных 500 нм, мы обнаружили небольшое увеличение эктопической dpERK для условий света 500 нм; это увеличение все еще было очень низким по сравнению с эндогенной активной ERK на краю неинъектированных эмбрионов (фиг. 3 A ). Эти уровни могут быть слишком низкими, чтобы вызвать удлинение желтка, что объясняет слабые фенотипические эффекты, описанные в предыдущем разделе. Когда те же стимулы применялись к эмбрионам, экспрессирующим psMEK ^E203K , световое воздействие 500 нм привело к гораздо более высоким уровням эктопической dpERK (рис.3 В ). Для обеих конструкций воздействие света 400 нм все еще поддерживало базальные уровни dpERK в немаргинальных клетках, что указывает на эффективную защиту активного сайта доменами pdDronpa в psMEK ^E203K , несмотря на гиперактивность этой оптимизированной конструкции (фиг. 3 B ). Таким образом, дестабилизирующая замена E203K увеличивает динамический диапазон нарушений передачи сигналов ERK, которые могут возникать у рыбок данио.

Рис. 3.

Эффекты оптимизированного psMEK у рыбок данио. ( A ) Количественная оценка конфокальных изображений 50% эмбрионов рыбок данио на стадии эпиболии, иммунофлуоресцентно окрашенных на dpERK.Эмбрионы, экспрессирующие psMEK (темно-серый), и неинъектированные эмбрионы WT (светло-серый) освещали светом 400 или 500 нм. Для количественной оценки эмбрионов, экспрессирующих psMEK, интенсивности dpERK из областей немаргинальных клеток были нормализованы к границам неинфицированных контрольных эмбрионов без инъекций. Немаргинальные клеточные области в контрольных неинъектированных эмбрионах были нормализованы по границам того же пула неинъектированных эмбрионов. Для условия 400 нм вводится N = 9, а N _{не вводится} = 9.Для условия 500 нм вводили N = 8 и не вводили N = 8. ( B ) Эквивалентные количественные оценки dpERK для эмбрионов, инъецированных psMEK, содержащих мутации SSDD и E203K (psMEK ^E203K ). Для условия 400 нм введено N = 12 и N _{не введено} = 12. Для условия 500 нм введено N = 15 и N _{не введено} = 17. * P <0,05. ( C ) Высокие уровни dpERK в эмбрионах, инъецированных psMEK ^E203K , возвращаются к нормальным уровням в течение 10 минут при переключении на свет 400 нм.Количественные оценки выполнялись, как описано в A , в каждый момент времени. N _{закачано} = {13,17,15} и N _{не закачано} = {10,13,17}. Числа N в фигурных скобках — это количество эмбрионов, измеренное в каждый момент времени в порядке от 0 до 20 минут после стадии 50% эпиболии. ( D ) Низкие уровни dpERK в эмбрионах, подвергнутых воздействию 400 нм, повышаются почти до максимальных уровней в течение 30 минут. N _{закачано} = {11,11,12} и N _{не закачано} = {11,11,12}. Числа N в фигурных скобках — это количество эмбрионов, измеренное в каждый момент времени в порядке от 0 до 30 минут после стадии 50% эпиболии.

Затем мы проверили, является ли активация оптимизированного psMEK быстро обратимой, переключая эмбрионы при 50% эпиболии со света 500 на 400 нм и наоборот. Высокие уровни dpERK, индуцированные у эмбрионов рыбок данио, подвергнутых воздействию света 500 нм, были потеряны в течение 10 минут в ответ на свет 400 нм (фиг. 3 C ). Напротив, эктопический dpERK у эмбрионов, первоначально подвергнутых воздействию света 400 нм, повышался до почти максимальных уровней к 30 мин при активации светом 500 нм (рис. 3 D ). Таким образом, дестабилизирующие мутации значительно увеличивают эффективность psMEK без ущерба для скорости и обратимости его активации светом.

Для исходной конструкции psMEK свет 400 нм требовался только для быстрого фотопереключения активации ERK и не требовался для поддержания неактивности psMEK (15). Мы обнаружили, что темноты также достаточно для поддержания неактивности psMEK ^E203K in vivo. Эмбрионы Drosophila , экспрессирующие psMEK или psMEK ^E203K , показали низкую летальность при хранении в темноте, что убедительно свидетельствует о том, что оптимизированный инструмент не протекает в условиях без освещения ( SI Приложение , рис.S5 A ). Эмбрионы рыбок данио, экспрессирующие psMEK ^E203K и хранящиеся в темноте, также имели только базальные уровни эктопического dpERK. Однако простое удаление источника света с длиной волны 500 нм не привело к быстрому обращению вызванной psMEK ^E203K эктопической активности ERK у эмбриона рыбок данио, что согласуется со свойствами исходной конструкции ( SI Приложение , рис. S5 B ) (15).

Настройка psMEK с мутациями.

Связанные с заболеванием активирующие мутации MEK лежат в спектре тяжести, которые можно использовать для дальнейшей настройки активности psMEK (28).Например, мутация, связанная с раком E203K, более сильно активирует, чем мутация G128V, обнаруженная в группе нарушений развития, совокупно называемых РАСопатиями (28, 37, 38). Чтобы проверить, сохраняется ли относительная сила болезненных мутаций при использовании для оптимизации psMEK, мы использовали тест овального эмбриона для тестирования 2 расширенных вариантов psMEK, содержащих либо дополнительную замену G128V (psMEK ^G128V ), либо замену E203K (psMEK ^E203K ). Действительно, psMEK ^G128V индуцировал соотношение сторон желтка ~ 1.2 при освещении 500 нм, что указывает на более низкий уровень передачи сигналов ERK для усиления функции по сравнению с psMEK ^E203K (соотношение сторон ~ 1,4) в тех же условиях (рис. 4 A ). Эмбрионы рыбок данио, которым инъецировали систему optoSOS, зависящую от синего света, демонстрировали только умеренно индуцированные светом фенотипы удлинения, которые не менялись при увеличении дозы введенной информационной РНК (мРНК), дополнительно подчеркивая, что оптимизированный psMEK является настраиваемым мощным инструментом для передачи сигналов ERK. исследования на эмбрионах рыбок данио ( SI Приложение , рис.S4).

Рис. 4.

Настройка и модуляция оптимизированного псМЭК. ( A ) Соотношения сторон (передне-задняя длина / дорсально-вентральная длина) для эмбрионов рыбок данио, которым вводили psMEK + G128V (psMEK ^G128V ) или psMEK + E203K (psMEK ^E203K ) на стадии хвостовой почки. Введенные эмбрионы освещали светом 400 или 500 нм. N _{psMEKG128V, 400 нм} = 63, N _{psMEKG128V, 500 нм} = 102, N _{psMEKE203K, 400 нм} = 99, и N _{psMEKE203K, 500 нм} = 97.( B ) Соотношения сторон для psMEK ^E203K , у которого отсутствуют мутации S> D в петле активации (обозначается как psMEK ^E203K –SSDD) при освещении светом 400 и 500 нм. N _{psMEKE203K -SSDD, 400 нм} = 36 и N _{psMEKE203K-SSDD, 500 нм} = 31. ( C ) Нормализованные соотношения сторон для эмбрионов, подвергнутых разной продолжительности 500 нм свет. Средние и стандартные значения показаны для бутстрепных соотношений сторон активированных инъецированных эмбрионов к непрерывно инактивированным (400 нм) эмбрионам-братьям и сестрам, которым инъецировали.Для возмущений 1, 2 и 3 эмбрионы, первоначально освещенные светом 500 нм, немедленно переключались на свет 400 нм в указанный момент времени. Все измерения проводились на стадии хвостовой почки. Количество измеренных эмбрионов следующее: N _OFF = 47, N _pert.1 = 34, N _{pert. 2} = 39, N _{чел. 3} = 47, а N _ON = 30. ( D ) Динамика соотношений сторон эмбрионов, инъецированных вариантами psMEK. Следы показывают растущее удлинение для эмбрионов, подверженных непрерывной активации psMEK ^E203K (черный), непрерывной активации psMEK ^G128V (серый), непрерывной инактивации psMEK ^E203K (пунктирный черный) и ограниченной активации psMEKE203K с 7 до 10 ч.ПФ. (пунктирная черная). В каждый момент времени показаны средние и SD для бутстрепных соотношений сторон активированных инъецированных эмбрионов к непрерывно инактивированным (400 нм) эмбрионам, получавшим инъекцию родственного брата. Количество эмбрионов, измеренное в условиях непрерывного освещения, следующее: N _{psMEKE203K, 500 нм} = {11,14,11,14}; N _{psMEKE203K, 400 нм} = {13,12,9,18}; N _{psMEKG128V, 500 нм} = {15,19,23,26}; и N _psMEKG128V, 400 нм = {14,20,25,16}.Количество эмбрионов, измеренных в условиях ограниченного освещения, следующее: N _{psMEKE203K, 500 нм 7–10hpf} = {33,22,23,23} и N _{psMEKE203K, 400 нм} = {24,22,25,23}. Все числа в фигурных скобках получены при ежечасных измерениях с 7 до 10 л.с. В A — D , * P <0,05.

Поскольку замена E203K сама по себе достаточно сильна для значительного удлинения эмбриона при сверхэкспрессии нефотопереключаемой MEK, необходимы ли фосфомиметические мутации в петле активации в оптимизированной psMEK ( SI, приложение , рис.S2) (28)? Чтобы ответить на этот вопрос, мы создали версию psMEK, которая содержала E203K, но не содержала S218D и S222D (называемая psMEK ^E203K –SSDD). Удивительно, но этот вариант psMEK не индуцировал овальный эмбрион при активации света (рис. 4 B ). Предыдущие исследования показали, что MEK-содержащие раковые мутации и мутации RASopathy не могут вызвать овальный эмбрион, если они содержат мутации S> A в петле активации, которые препятствуют фосфорилированию с помощью RAF, что указывает на то, что фосфорилирование влияет на функцию MEK с заменой E203K (20).Домены pdDronpa могут изменять взаимодействия psMEK-RAF, которые могут мешать важному этапу фосфорилирования. Это наблюдение свидетельствует о том, что оптимизированный psMEK действительно не зависит от восходящих сигналов, и как фосфомиметические, так и дестабилизирующие замены, такие как E203K, необходимы для генерации варианта psMEK с большим динамическим диапазоном.

Зависящие от времени возмущения с использованием psMEK

^E203K .

Предыдущее оптогенетическое исследование продемонстрировало, что варьирование уровня или продолжительности активности ERK может регулировать подобные переключателям решения клеточной судьбы у эмбриона Drosophila (5).С psMEK ^E203K , теперь у нас есть идеальный инструмент для исследования аналогичного соответствия между продолжительностью и дозой у эмбрионов рыбок данио, где мы ранее обнаружили, что доза ERK обеспечивает реостатный контроль удлинения желтка (28). Мы переключили эмбрионы с активации на инактивирующий свет в более поздние моменты времени и обнаружили, что фенотипическая серьезность увеличивалась пропорционально продолжительности активирующего света (рис. 4 C ). Эти пертурбации показывают, что фенотип овального эмбриона отражает накопление передачи сигналов ERK с течением времени.Это наблюдение контрастирует с тем, что мы обнаружили у эмбриона Drosophila , где активации psMEK ^E203K в первые 4 часа эмбриогенеза было достаточно, чтобы вызвать максимальную летальность ( SI Приложение , Рис. S6) (7). Мы наблюдали почти 100% летальность для 4-часовой активации psMEK ^E203K , что выше, чем для 4-часовой стимуляции optoSOS, возможно, из-за более прямой активации ERK на уровне MEK ( SI Приложение , рис. S6).Эти результаты также согласуются с результатами, полученными в исследованиях на рыбках данио, в которых применялись фармакологические ингибиторы для отключения эктопической передачи сигналов ERK в разные моменты времени (26).

С другой стороны, ранее было показано, что воздействие ингибитора МЭК PD-184352 в 1-часовом временном окне от 4,5 до 5,5 л.с. было достаточно для подавления фенотипа овального эмбриона у RAF-мутантных эмбрионов с избыточной функцией (26). Этот эксперимент предполагает, что необходима эктопическая передача сигналов ERK в этом коротком временном окне до 5.5 л.с. для создания удлиненного зародыша. Другими словами, первое проявление эктопических сигналов ERK после 5,5 л.с. не привели к овальному эмбриону. Напротив, мы обнаружили, что активация psMEK ^E203K вызвала обнаруживаемое и статистически значимое удлинение эмбриона, даже когда свет впервые был доставлен на уровне 7 л.с. (Рис.4 D , пунктирная линия). Эффекты эктопической ERK ощущались даже при появлении ранжированного фенотипа овального эмбриона, что означает, что эмбрион остается чувствительным к эктопической активации ERK за пределами временного окна, оцененного с помощью фармакологических ингибиторов (рис.4 D ). Эти различия могут быть связаны с неполным вымыванием ингибитора MEK, что приводит к частичному ингибированию в более поздние моменты времени или к более сильной активации, достигаемой путем прямой активации MEK. Модуляция активности psMEK ^E203K светом также принципиально отличается от вымывания и вымывания небольших молекул, поскольку наш инструмент контролирует только эктопический ввод ERK, а не эндогенный сигнальный каскад. Таким образом, оптимизированная psMEK позволила нам обнаружить, что эктопическая активная ERK фактически ощущается на протяжении всей 10-часовой траектории, а не только до определенного момента времени.

Фенотип овального эмбриона, вероятно, отражает измененную динамику движений конвергенции и вытягивания, которые изменяют форму эмбриона в 3-часовом временном окне, когда происходит быстрое удлинение оси тела (Fig. 4 D ) (39). Предыдущие исследования показали, что эти движения, в свою очередь, негативно регулируются сигнальным путем костного морфогенетического белка (BMP), предполагая, что эктопическая передача сигналов ERK, вызванная оптимизированной psMEK, может нарушить эндогенный паттерн передачи сигналов BMP в эмбрионе (24, 25, 40). , 41).Мы обнаружили, что это действительно так: активация светом нарушает характерный вентрально-дорсальный градиент активации пути BMP ( SI Приложение , Fig. S7). Таким образом, активируемая светом MEK может быть использована для исследования того, как эффекты активации ERK распространяются по более крупной сети формирования паттерна, которая контролирует спецификацию клеточной судьбы и морфогенез у эмбриона.

Обсуждение

psMEK обеспечивает наиболее прямое управление сигнальным каскадом ERK на основе света (15).В этом исследовании мы обнаружили, что эффективность этой важной технологии in vivo ограничена. В конструкции psMEK в настоящее время реализованы сконструированные домены Dronpa для использования слабой конститутивной активности MEK, обеспечиваемой фосфорномиметическими мутациями. Мы обнаружили это ограничение при характеристике индуцированных светом фенотипов, которые широко применялись как считывание дерегулированной передачи сигналов ERK. У эмбриона плодовой мушки, где очень низкий порог эктопической передачи сигналов ERK вызывает тяжелые и летальные дефекты, psMEK обеспечивает светозависимый контроль ожидаемых фенотипов (рис.1 С ). Эмбрионы рыбок данио, по-видимому, менее чувствительны к эктопическим активным уровням ERK и не обнаруживают светозависимых дефектов при экспрессии psMEK (Fig. 1 D ). Хотя фенотип рыбок данио может представлять собой аномальный случай, требующий необычно высоких уровней передачи сигналов ERK, мы показали, что фосфомиметические замены сами по себе слабо активируют и, следовательно, ограничивают функциональность psMEK (Fig. 2 C — E ).

Мы предлагаем простую стратегию для устранения этого ограничения: использовать мутации, дестабилизирующие МЕК, для повышения эффективности psMEK.Этот подход не только радикально улучшает не зависящую от фосфорилирования активность MEK, но также настраивает psMEK для более специализированных оптогенетических входов. Оптимизированный psMEK по-прежнему быстро контролирует активность пути ERK in vivo, что позволяет нам создавать синтетические входы ERK в широком диапазоне контекстов развития. В качестве иллюстрации этого подхода мы использовали наш оптимизированный psMEK для возмущения ERK-зависимого морфогенетического события у эмбрионов рыбок данио. Наши результаты показывают, что серьезность возникающего морфогенетического дефекта в этой системе зависит от продолжительности эктопической активации ERK.

Эти синхронизированные возмущения были однозначно разрешены оптимизированной psMEK, поскольку optoSOS не вызывал серьезных дефектов в эмбрионе рыбок данио. Положительные обратные связи SOS-Ras могут управлять адаптацией путей и ограничивать общие эффекты системы у эмбрионов рыбок данио ( SI Приложение , рис. S4) (13, 14). В Drosophila optoSOS может вызывать серьезные дефекты, но также приводит к утечке активности ERK в окружающем комнатном освещении. Мы обнаружили, что psMEK пропускают значительно меньше активности при освещении комнатным светом, и поэтому их легче внедрить в другие системы ( SI, приложение , рис.S8).

Наконец, оптимизированный psMEK обеспечивает широкий класс комбинаторных возмущений, при которых световая стимуляция может сочетаться с ингибиторами, которые действуют на этапах передачи сигнала, предшествующих взаимодействиям MEK-ERK (рис. 5). Такие эксперименты были бы важным шагом к пониманию взаимодействия между эндогенными и эктопическими входными сигналами, которые могут лежать в основе сложных эффектов передачи сигналов ERK в системах развития (23).

Рис. 5.

Оптимизированный psMEK допускает комбинаторные возмущения.Фармакологическое ингибирование перед MEK (синий) можно комбинировать с оптимизированным psMEK для независимой модуляции эндогенных (лиганд-зависимых) и эктопических (оптогенетических) входов ERK.

Материалы и методы

Измерение летальности у

Drosophila .

Последовательность psMEK клонировали в вектор трансформации pTIGER по сайтам KpnI и PspXI с использованием набора для слияния TakaraBio. Конструкции были интегрированы во вторую хромосому с использованием интеграции Phi-C31 в сайтах attP через балансировщик CyO.Девственных самок трансгенных мух, экспрессирующих psMEK, скрещивали с самцами MTD-GAL4. Следующее поколение от этого скрещивания было переведено в племенную клетку для сбора эмбрионов на тарелке яблочного сока, содержащей пекарские дрожжи. Клетки содержались в коробке, покрытой алюминиевой фольгой, и подвергались воздействию светодиодных пластин, излучающих свет с длиной волны 405 и 505 нм. Светодиоды со сквозными отверстиями T1-3 / 4 были куплены на https://www.superbrightleds.com/ и впаяны в специальную печатную плату от SEEED Studio. Примерно 2 Вт обеспечил блок питания Korad KA3005D, приобретенный по адресу https: // www.amazon.com/. Эмбрионы собирали в течение 2–3 часов, после чего пластину яблочного сока вынимали из клетки и держали внутри светового бокса более 36 часов. Коэффициент вылупления через 36 часов после сбора был измерен как показатель летальности.

Измерение фенотипа удлиненного эмбриона у рыбок данио.

Все формы psMEK экспрессировали посредством инъекции 100 мРНК, транскрибированной с помощью набора Ambion mMessage Machine SP6, в желток на стадии одноклеточной. Каждая инъекция осуществлялась в виде болюса объемом 500 мкл, содержащего мРНК 200 мкг / нл, доставляемого с помощью пневматического насоса PV280 PicoPump (World Precision Instruments).Инъецированные эмбрионы содержались в 5-сантиметровых чашках из стекла Pyrex, помещенных в коробку, облицованную алюминиевой фольгой, непосредственно под теми же светодиодными панелями, описанными выше, для обеспечения равномерного освещения не более чем через 20 минут после инъекции, и инкубировали при 30 ° C. Соотношение сторон желтка измеряли, когда эмбрионы достигли стадии хвостовой почки (при 10 л.с.в этих экспериментах). Эмбрионы были ориентированы латерально и отображены на стереомикроскопе Leica M205 FA. Все измерения были выполнены с использованием инструментов анализа изображений в FIJI. Статистические данные для нормализованных соотношений сторон желтка рассчитывали путем генерирования распределения соотношений, измеренных для каждого возмущения, к «выключенному» контролю (активация 400 нм в течение 10 ч) посредством отбора образцов с заменой.Были рассчитаны средние и стандартные отклонения сгенерированных распределений. Значимость была указана, если распределения 2 средних выходили за пределы 95% доверительного интервала. Все протоколы по рыбкам данио соответствовали правилам и положениям, установленным Комитетом по уходу и использованию животных Принстонского университета.

Измерение активности киназы варианта МЕК.

Конструирование плазмид и очистка белков.

Плазмиды pET28a, содержащие на N-конце His6-меченную человеческую MEK (His ₆ -MEK), были получены в качестве подарка от E.Голдсмит, Юго-западный медицинский центр Техасского университета, Даллас, Техас. Фосфомиметический вариант MEK-SSDD был сконструирован, как описано ранее (23). Мутация E203K была введена в плазмиду MEK-SSDD путем ПЦР-амплификации плазмиды с GTCAACTCCCGTGGG aag ATCAAGCTCTGTGAC в качестве прямого праймера и GTCACAGAGCTTGAT ctt CCCACGGGAGTTGAC в качестве обратного праймера. Десять нанограмм плазмиды, 1 мкМ каждого праймера, 250 мкМ dNTP, 1 × буфер PfuUltra II (Agilent Technologies) и 1 мкл высокоточной ДНК-полимеразы PfuUltra II Fusion HS (Agilent Technologies 600674) инкубировали вместе для ПЦР (25 циклов, денатурирующая температура 55 ° C, продление на 2 мин).Продукт ПЦР расщепляли DpnI и трансформировали в домашнюю клетку DH5α. Наличие мутаций было подтверждено секвенированием по Сэнгеру. Варианты His ₆ -ERK K52R и His ₆ -MEK были очищены точно, как описано ранее (23).

Киназные реакции in vitro.

Все реакции проводили в буфере фосфорилирования, содержащем 50 мМ Hepes, pH 7,2, 20 мМ MgCl ₂ и 5 мМ АТФ. Raf-активированный MEK WT получали по реакции 6.5 мкМ МЕК с 0,05 мкМ активного c-Raf (c-Raf 14–325-D Millipore) в течение 1,5 ч при 30 ° C. Для всех реакций MEK-ERK 0,67 мкМ MEK реагировало с 5 мкМ ERK K52R. Аликвоты для определенных моментов времени собирали путем добавления 4 мкл реакционной смеси к 1,5 мкл загрузочного буфера с 4 × додецилсульфатом натрия (SDS) (250 мМ Tris⋅HCl, pH 6,8, 10% SDS, 0,01% бромфенолового синего, 40% глицерина , 2,86 М β-меркаптоэтанол). Для разрыва дисульфидных связей аликвоты кипятили при 60 ° C в течение 10 мин, и 5 мкл каждой аликвоты загружали на Wako SuperSep Phos-tag 12.5% 17-луночный гель (Wako 195–17991) и прогон при 175 В в течение 2 часов и 40 минут с рабочим буфером Трис / Глицин / SDS (Bio-Rad 1610732). Гель окрашивали окрашивающим раствором кумасси R (0,05% мас. / Об. Кумасси бриллиантового синего R, 25% изопропанола и 10% уксусной кислоты) в течение 30 минут перед обесцвечиванием 10% уксусной кислотой до тех пор, пока полосы не стали четко видны. Гели с фос-метками были визуализированы с использованием системы визуализации Bio-Rad ChemiDoc MP. Интенсивность полос была количественно определена с помощью инструмента ImageJ’s «гели», и количественные значения были нормализованы так, чтобы сумма всех видов в каждый момент времени была равна 1.В момент времени 0 нефосфорилированная ERK имела концентрацию 5 мкМ, и концентрацию каждого вида можно рассчитать путем нормализации количественной интенсивности геля к интенсивности нефосфорилированного ERK в момент времени 0.

Генерирование мутаций в psMEK.

Конструкция psMEK была клонирована из плазмиды, опубликованной в ссылке. 15 в вектор PCS2 + посредством клонирования In-Fusion (TakaraBio). Мутация G128V была произведена мутагенезом Q5. Мутации E203K и D> S в положениях 218 и 222 были получены с использованием протокола мутагенеза клонирования TakaraBio In-Fusion.

dpERK Иммунофлуоресценция и количественное определение у рыбок данио.

dpERK иммунофлуоресценцию выполняли точно, как описано в ссылке. 23. Дронпа окрашивали с использованием мышиных антител (MBL International), добавленных в разведении 1: 500. Введенные и неинфицированные эмбрионы окрашивали вместе в одной пробирке. Окрашенные эмбрионы помещали сбоку в 1,5% легкоплавкую агарозу в чашки со стеклянным дном. Все эмбрионы были получены в лазерном конфокальном сканирующем микроскопе Nikon A1RSi. Z-стеки были обработаны в Imaris, а снимки изображений были проанализированы в FIJI.Эмбрионы, положительные по Dronpa, указывали, где рисовать интересующую область (ROI) для измерения интенсивности окрашивания dpERK. Нарисованные от руки области интереса, окружающие края на Dronpa-негативных изображениях, использовались для измерения уровней dpERK на краях эмбрионов WT. Количественно определенные уровни dpERK в немаргинальных клетках сравнивали с границами WT путем построения распределения отношения уровней в немаргинальных клетках к маргинальным клеткам после 100 выборок с событиями замещения (бутстреппинг). Были рассчитаны средние и стандартные отклонения немаргинальных: маржинальных соотношений, полученных с помощью бутстрэппинга.Значимость была указана, если распределения 2 средних выходили за пределы 95% доверительного интервала.

dpERK Иммунофлуоресценция и количественное определение у

дрозофил.

Окрашивание антител к dpERK проводили, как описано в ссылке. 42. Эмбрионы собирали в течение 1 часа в темноте и выдерживали в течение 2 часов и 15 минут в световом боксе с длиной волны 500 нм. Фиксацию параформальдегидом также проводили при освещении 500 нм. Эмбрионы OreR окрашивали вместе с эмбрионами, экспрессирующими psMEK и psMEK ^E203K , в качестве контролей WT.Сообщается об уровнях dpERK при 50% длины эмбриона.

Заявление о доступности данных.

Все данные включены в рукопись SI и Приложение .

Благодарности

Мы благодарим Филипа Джонсона и сотрудников Лаборатории животных ресурсов (LAR) за заботу о рыбках данио; Майкл Лин для плазмид; Д-ру Гэри Лаевски и Центру конфокальной микроскопии молекулярной биологии, который является центром передового опыта Nikon, за поддержку микроскопии; и лабораторию Алексея Корренных (Молекулярная биология, Принстонский университет) за использование их аппарата для количественной ПЦР и помощь в эксперименте с термо-сдвигом.Мы благодарим Грантона Джиндала и всех членов S.Y.S. и R.D.B. лаборатории за полезные обсуждения. A.L.P. благодарит Rajeshwari Enjeti за ее вклад в разработку иммунофлуоресценции p-Smad5 и процедур количественной оценки у рыбок данио. Эта работа была поддержана грантом программы стипендий для аспирантов Национального научного фонда DGE-1656466 (для A.L.P.). S.Y.S. и R.D.B. были поддержаны грантом NIH GM086537. J.E.T. был поддержан Национальным научным фондом CAREER Award 1750663.Любые мнения, выводы, выводы или рекомендации, выраженные в этом материале, принадлежат автору (авторам) и не обязательно отражают точку зрения Национального научного фонда.

Сноски

• Вклад авторов: A.L.P., R.D.B. и S.Y.S. разработанное исследование при технической поддержке J.E.T .; A.L.P., E.Y., S.E.M. и A.Y.W. проведенное исследование; A.L.P. внесены новые реагенты / аналитические инструменты; A.L.P. и Э. проанализированные данные; и A.L.P., R.D.B. и S.Ю.С. написал статью при участии J.E.T.

• Авторы заявляют об отсутствии конкурирующей заинтересованности.

• Эта статья представляет собой прямое представление PNAS.

• Эта статья содержит вспомогательную информацию в Интернете по адресу https://www.pnas.org/lookup/suppl/doi:10.1073/pnas.10116/-/DCSupplemental.

Фоточувствительные аналоги тирозина раскрывают сайт-зависимое фосфорилирование в TrkA, инициированное передачей сигналов MAPK / ERK

Сайт-специфическое включение ONB и AzF в TrkA-Y490

Чтобы установить сайт-специфическое включение ONB и AzF (рис.1a) в TrkA, мы сначала сконструировали рецептор TrkA (wt), меченный EGFP, и рецептор TrkA с мутацией янтарного кодона (Y490amb) (рис. 1b), чтобы обнаружить их экспрессию в клетках млекопитающих с использованием флуоресцентного сигнала. На основе этой версии wt в положение Y490 была введена мутация янтаря (UAG) для генерации TrkA (490amb). При совместной экспрессии TrkA (490amb) с плазмидой, кодирующей pONBYRS / U6-PyltRNA ²⁹ , ортогональной ONB (фиг.1c), или плазмидой, кодирующей AzF-RS / Bst-tRNA _CUA ³¹ , ортогональной AzF ( Инжир.1d) в присутствии 1 мМ Uaa в клеточной среде можно наблюдать флуоресцентные сигналы, что свидетельствует об успешном включении ONB или AzF в каждом состоянии. Эту конструкцию AzF-RS / Bst-тРНК _CUA сравнивали с плазмидами, отдельно кодирующими Ecoli AzF-RS и Bst-тРНК _CUA ^Tyr , показывая аналогичные уровни экспрессии, количественно определяемые двойным репортером EGFP-mCherry ³¹ (Дополнительный рис. 1). В отсутствие AzF наблюдается минимальный уровень флуоресцентного сигнала, что позволяет предположить, что Ecoli AzF-RS и Bst-тРНК _CUA ^Tyr ортогональны как в клетках HEK293T, так и в PC12 с минимальным уровнем ошибочного включения в стоп. кодон.

Рис. 1: Включение ONB и AzF в TrkA.

a Структура ONB и AzF. b Схематическая диаграмма сконструированного рецептора TrkA, меченного EGFP на С-конце. Полноразмерный рецептор wt-TrkA состоит из внеклеточного домена (ECD), трансмембранного домена (TM), внутриклеточного домена (iTrkA) и EGFP. TrkA (Y490amb) имеет янтарную мутацию (UAG), введенную в позицию Y490 в домене iTrkA. c , d Флуоресцентные изображения живых клеток, котрансфицированных RS / тРНК _4x на одном сайте из тирозинкиназного домена Y490, в присутствии (+) или отсутствии (-) 1 мМ AzF ( c ) и 1 мМ ONB ( d ).

Чтобы количественно оценить уровень экспрессии TrkA-EGFP, мы сначала установили процедуру количественной оценки с использованием обычной растворимой репортерной конструкции EGFPamb ³¹ , которая дает белок экспрессии полной длины только тогда, когда мутация янтаря в положении Y39 подавлена ​​(дополнительный рис. 2а), при этом 44% клеток, котрансфицированных EGFPamb и AzF-RS / Bst-тРНК _CUA , проявляют флуоресценцию при добавлении AzF, по сравнению со 100% клеток, трансфицированных EGFP дикого типа. В TrkA (490amb) -EGFP их было 52.6% клеток проявляют флуоресценцию при добавлении AzF по сравнению со 100% клеток, трансфицированных TrkA-EGFP (рис. 1d и дополнительная таблица 1), что указывает на значительный выход мембранного рецептора TrkA-EGFP, который сравним с водой -растворимый EGFP.

Использование клеток HEK293T для сайт-зависимой активации TrkA ERK

Связывание NGF с TrkA индуцирует сигнальные каскады AKT или MAPK / ERK, и сайт Y490 был связан с этими двумя путями, что было установлено с помощью масс-спектрометрического анализа ¹⁸ (фиг. .2а). Чтобы определить TrkA-зависимый путь активации, мы исследовали эндогенную активацию TrkA MAPK / ERK в клеточных линиях HEK293T и PC12. Клетки HEK293 являются популярными клетками-хозяевами для экспрессии генов и анализа экспрессируемого белка из-за его переносимости различными методами. Для сравнения, клетки PC12 полезны в качестве модельной системы для дифференцировки нейронов NGF и нейросекреции. Мы определили активацию MAPK / ERK с помощью иммуноблот-анализа фосфорилированных ERK (p-ERK1 / 2, Thr202 и Tyr204), фосфорилированных Akt и фосфорилированных creb (p-creb, Ser133) (рис.2б). В обоих случаях клетки HEK293T и клетки PC12 обрабатывали NGF в течение 10 минут. После нанесения лиганда клетки немедленно лизировали и зондировали на TrkA, p-erk, p-akt, p-creb и актин в качестве контроля загрузки. В клетках HEK293, где было обнаружено небольшое количество эндогенного TrkA (с наблюдаемой слабой полосой), нет определяемого p-erk. Напротив, клетки PC12 показали высокий уровень экспрессии TrkA, он показал сильный p-erk. Для обеих клеток наблюдались аналогичные уровни p-creb и p-Akt. Клетки HEK293T, трансфицированные TrkA, демонстрировали сигнал p-erk, демонстрируя четкий контраст с нетрансфицированными клетками (рис.2в).

Рис. 2: Активация ERK с помощью TrkA.

a Схематическая диаграмма сигнального пути TrkA. b Вестерн-блоттинг клеток PC12 и HEK293T за счет эндогенного TrkA в присутствии лиганда NGF для p-erk (фосфорилированный ERK по Thr202 и Tyr204), фосфорилированный akt, фосфорилированный CREB. β-актин использовали в качестве контроля нагрузки. c Вестерн-блоттинг клеток HEK293T в нетрансфицированных (Ø) и трансфицированных wt-TrkA (wt) зондировании на эндогенные TrkA, p-erk и общую ERK.β-актин использовали в качестве контроля нагрузки. d Вестерн-блоттинг клеток HEK293T, экспрессирующих wt-TrkA, без (-) или с (+) NGF, и без (-) или с (+) УФ-светом, для pERK. β-актин использовали в качестве контроля нагрузки.

Чтобы напрямую сравнить экспрессию TrkA, включенного в Uaa, в клетках HEK293T или PC12, мы котрансфицировали низкодифференцированные клетки PC12, используя тот же протокол, что и в клетках HEK293T, сохраняя TrkA-Y490amb и AzF-RS / Bst-tRNA _CUA. при тех же дозах гена.Мы наблюдали, что выход в клетках PC12 значительно ниже (3% от WT-TrkA) (дополнительные рисунки 3 и 4), чем в клетках HEK293 (52,6% от WT-TrkA), предположительно из-за проблемы с опосредованным липофектамином переходным процессом. трансфекция в линии нейрональных клеток. Далее мы охарактеризовали TrkA-Y490AzF индуцированную активацию ERK в клетках HEK293 (рис. 2). Экспрессию TrkA-Y490AzF в клетках HEK293T анализировали с помощью флуоресцентной визуализации и вестерн-блоттинга с использованием TrkA дикого типа в качестве контроля (дополнительный рис.5), что свидетельствует о всеобщем согласии. TrkA-Y490AzF был синтезирован только в тех клетках, которые совместно экспрессируют Ecoli AzF-RS и Bst-тРНК _CUA ^Tyr в присутствии экзогенно добавленного AzF (дополнительные рис. 5a – c, дорожка 4). В отсутствие AzF мы не наблюдали экспрессии TrkA с помощью вестерн-блоттинга (дополнительный рис. 5a – c, дорожка 3) и только незначительный сигнал EGFP (дополнительный рис. 5a, b, дорожка 3), подтверждая остановку трансляции. Измерение сигналов EGFP позволило нам количественно определить уровень экспрессии TrkA-Y490AzF, который неизменно составлял 52.6% уровней экспрессии TrkA дикого типа. Таким образом, мы использовали EGFP для визуализации экспрессии TrkA. Затем мы изучили активацию p-erk TrkA-Y490AzF. Интересно, что иммуноблот-анализ p-ERK показал, что мутант TrkA-Y490AzF не может инициировать p-erk (дополнительный рис. 5c), показывая, что замена азидогруппы в сайте Y490 ингибирует аутофосфорилирование. Таким образом, эти результаты показали, что HEK293T представляет собой удобную клеточную модель по сравнению с клетками PC12 для экспрессии TrkA сайт-специфически включенного с UAA и изучения передачи сигналов MAPK / ERK.В отличие от PC12 с высоким уровнем эндогенной экспрессии TrkA, HEK293T имеет низкий уровень эндогенного TrkA, он проявляет четкую активацию p-erk только тогда, когда экспрессируется экзогенный TrkA.

Включение AzF и ONB в сайты домена тирозинкиназы

Используя сайт Y490 в качестве ссылки, мы затем изучили включение AzF и ONB в TrkA в трех разных сайтах в домене тирозинкиназы, Y670, Y674 и Y675. соответственно (рис. 3а). Анализ флуоресцентной визуализации показал, что мутанты TrkA-AzF продуцировались до ~ 50% (в диапазоне от 33.От 4 до 52,6%) WT-TrkA (рис. 3b, дополнительный рисунок 6a и дополнительная таблица 1). Для сравнения, все мутанты TrkA-ONB имели немного более низкий уровень экспрессии, чем мутанты, содержащие AzF, в диапазоне от 29,1 до 35,8% от WT-TrkA (фиг. 3c, дополнительный рисунок 6b и дополнительная таблица 1). Рассчитывали средние урожаи мутантов TrkA (дополнительная таблица 1). Различия в выходах, измеренных с помощью флуоресцентной визуализации, в целом позволяют предположить, что мы наблюдаем эффективное подавление янтаря на различных участках-мишенях и, следовательно, эффективный синтез рецепторных белков, содержащих AzF и ONB.Кроме того, WT-TrkA и его мутантные варианты локализованы преимущественно на плазматической мембране (дополнительный рис. 7a, b).

Фиг. 3: Экспрессия мутантов TrkA, содержащих AzF или ONB в положениях 490, 670, 674 и 675 соответственно.

a Схематическая диаграмма полноразмерного TrkA с ECD, TM и внутриклеточными доменами TrkA. Лиганд NGF связывается с доменом ECD. Выделены четыре сайта фосфорилированного тирозина, подвергнутые мутации. b Эффективность включения мутантов TrkA AzF в отсутствие (серый цвет) или присутствие (темный цвет) AzF. c Выражение эффективности включения мутантов TrkA ONB в отсутствие (серый цвет) или присутствие (темный цвет) ONB. Эффективность включения описывалась как процентное отношение средней интенсивности флуоресценции в клетках, экспрессирующих рецепторы, включающие Uaa, к средней интенсивности флуоресценции в клетках, экспрессирующих рецепторы WT. n = 6 независимых экспериментов. Полосы ошибок показывают s.d.

УФ-инициированная сайт-зависимая передача сигналов ERK

Мы сначала протестировали УФ-стимулированную активацию p-erk с мутантом TrkA-Y490ONB.Под воздействием ультрафиолетового света ONB высвобождает заключенную в клетку группу, которая восстанавливает тирозин, а гидроксильная группа тирозина подвергается аутофосфорилированию (дополнительный рис. 8a и дополнительный рис. 11a, b). Чтобы оценить, вызывает ли фотоактивация ONB в сайте Y490 функциональные изменения в передаче сигналов ERK, мы применили УФ-свет к живым клеткам, экспрессирующим мутант, и с помощью иммуноблот-анализа p-erk после УФ-обработки. Клетки HEK трансфицировали TrkA-Y490ONB и подвергали непрерывной стимуляции УФ-светом (40 Вт) в течение 5 мин в присутствии лиганда NGF.После освещения клетки немедленно лизировали и исследовали на p-erk, общий erk и актин в качестве контроля нагрузки. В отсутствие УФ-света p-erk не был обнаружен в TrkA-Y490ONB из-за присутствия заключенной в клетку группы в ONB. УФ-освещение вызывало более четкое появление p-erk по сравнению с контрольным TrkA-Y490ONB (рис. 4а). Таким образом, наши результаты успешно продемонстрировали возможность активации p-erk посредством контроля света в единственном сайте фосфорилирования в TrkA, в котором Uaa ONB служит надежным переключателем света для контроля состояния фосфорилирования.

Фиг. 4: УФ-свет активирует сигнальный путь MAPK / ERK посредством сайт-специфически включенных AzF и ONB в TrkA.

Вестерн-блоттинг клеток HEK293T, экспрессирующих мутанты ONB для фосфорилированной ERK (Thr202 и Tyr204) в присутствии лиганда NGF без (-) или с (+) УФ-светом. b Связывание NGF запускает димеризацию TrkA, аутофосфорилирование и инициирует внутриклеточную MAPK / ERK. В присутствии лиганда NGF ONB, включенный в сайты Y490, Y674 и Y675 (закрашенные кружки) в TrkA, соответственно, после УФ-обработки инициирует внутриклеточную передачу сигналов MAPK / ERK (стрелки).ONB, включенный в сайт Y670 (пустой кружок), не инициирует внутриклеточную передачу сигналов MAPK / ERK (ингибированная стрелка) c Вестерн-блот-анализ клеток HEK293T, экспрессирующих мутанты AzF для фосфорилированных ERK (Thr202 и Tyr204) без (-) или с (+) УФ-свет. УФ-фотолиз выполняли с помощью сшивающего агента УФ-сшивания 365 нм CL-1000L (Analytik Jena) при 40 Вт в течение 5 мин при 4 ° C. TrkA и β-актин использовали в качестве контроля нагрузки. d Связывание NGF запускает димеризацию TrkA, аутофосфорилирование и инициирует внутриклеточную MAPK / ERK.В присутствии лиганда NGF, AzF, включенный в сайты Y670, Y674 и Y675 (закрашенные кружки) в TrkA, соответственно, после УФ-обработки инициирует внутриклеточную передачу сигналов MAPK / ERK (стрелки), предположительно за счет перекрестного связывания с предполагаемым интерактивным белком. AzF, включенный в сайт Y490 (пустой кружок), не инициирует внутриклеточную передачу сигналов MAPK / ERK (ингибированная стрелка).

Затем мы изучили, может ли включение ONB в любой из трех других тирозинов также инициировать передачу сигналов p-erk в TrkA-670, 674 и 675 (рис.4а и дополнительный рис. 11). В отсутствие УФ-обработки не было обнаружено p-erk ни ​​для одного из мутантов. После УФ-обработки два мутанта (TrkA-Y674ONB и TrkA-Y675ONB) показали сильную активацию p-erk, аналогичную той, что наблюдалась у мутанта TrkA-Y490ONB. Интересно, что мутант TrkA-Y670ONB не обнаружил детектируемого p-erk с УФ-обработкой или без нее. Чтобы количественно оценить степень p-erk, интенсивность сигнала p-erk была измерена и нормализована к общему сигналу ERK среди всех мутантов в темноте или при УФ-освещении (дополнительный рис.9а и таблица 1). После стимуляции УФ-светом TrkA-Y490ONB инициировал 36,2% p-erk, TrkA-Y674ONB инициировал 44,6%, а TrkA-Y675ONB инициировал 32,0%, что значительно больше, чем отсутствие контроля УФ-излучения (16,3%, 7,3% и 4,4% соответственно. ) и нечувствительный к свету мутант TrkA-Y670ONB (отсутствие УФ: 3,1%, присутствие УФ: 3,6%). В качестве дополнительного контроля мы сделали обычные мутанты, а именно: TrkA-Y490F, Y670F, Y674F, Y675F, Y490D, Y670D, Y674D и Y675D. Считается, что фенилаланин (F) отменяет фосфорилирование, тогда как аспарагиновая кислота (D) может имитировать фосфорилированное состояние.Для всех мутантов F мы наблюдали значительное снижение p-erk по сравнению с рецепторами дикого типа (дополнительный рис. 10). Эти результаты продемонстрировали, что ONB в качестве переключателя света достаточно для усиления функции, чтобы индуцировать передачу сигналов нижестоящего ERK, обеспечиваемую включением в соответствующий сайт регуляции фосфорилирования (рис. 4b). Среди трех тирозинов (Y670, Y674 и Y675), находящихся в петле активации киназного домена TrkA, Y674 и Y675 (но не Y670) могут использовать те же механизмы, что и Y490, для инициации передачи сигналов pERK путем аутофосфорилирования.

Таблица 1 Все сайты были обнаружены в тех же условиях, что и wt, и были повторены более трех раз.

Затем мы исследовали среди всех четырех участков индуцированный светом эффект AzF, фотохимия которого отличается от фотохимии ONB. При УФ-возбуждении AzF обычно генерирует нитреновый радикал, который может восстанавливаться до амина или образует ковалентную связь с соседним атомом белка на расстоянии 3–4 Å ^30,32 (дополнительный рис. 8b). Поразительно, за исключением мутанта TrkA-490AzF, у которого не обнаруживается p-erk после стимуляции УФ-светом (отсутствие УФ: 11.4%, присутствие УФ: 7,8%), все три мутанта TrkA-Y670AzF, TrkA-Y674AzF и TrkA-Y675AzF продемонстрировали УФ-контролируемую активацию p-erk (34,1%, 29,7% и 37,4% соответственно) (рис. 4c, дополнительный рис. 9a и таблица 1), значительно больше, чем их контроли, обработанные без УФ (12,4%, 12,5% и 10,1% соответственно). Интересно, что мутанты Y674D и Y675D также продемонстрировали разные уровни снижения p-erk. Мутанты Y490D и Y670D сохраняли тот же уровень активации pERK по сравнению с WT.Взятые вместе, эти результаты показывают, что AzF может служить переключателем света для активации нижестоящей передачи сигналов ERK в рецепторах TrkA, предположительно через опосредованный AzF механизм фото-перекрестного связывания (рис. 4d), который отличается от фотохимии, которая генерирует фениламино боковая цепь (дополнительный рис. 8а, б).

NGF-независимая свето-контролируемая передача сигналов ERK

Затем мы проверили, может ли УФ-световая стимуляция в TrkA напрямую активировать ERK без NGF (рис. 5a и дополнительный рис.11j – m). Все мутанты были экспрессированы и проанализированы в отсутствие и в присутствии NGF, и wt-TrkA служит контролем без детектируемого p-erk ни ​​без, ни с УФ-обработкой, подтверждая, что УФ-обработка сама по себе не вызывает значительных функциональных изменений. Интересно, что среди четырех мутантов ONB в отсутствие NGF как TrkA-Y674ONB, так и TrkA-Y675ONB проявляли УФ-индуцированную активацию p-erk по сравнению с контролем без УФ-обработки (80,4% и 39,0% соответственно) (рис. 5b, Дополнительный рис.9б и таблица 1). УФ-зависимая активация была аналогична контролю, обработанному в присутствии NGF. Напротив, TrkA-Y490ONB демонстрировал активацию p-erk, индуцированную УФ-светом, только в присутствии NGF, тогда как TrkA-Y670ONB не обнаруживал детектируемой активации p-erk во всех условиях (рис. 5b, c). Мы повторили тот же эксперимент с мутантами AzF, аналогичными TrkA-Y674ONB и TrkA-Y675ONB, TrkA-Y674AzF и TrkA-Y675AzF имели независимую от NGF УФ-индуцированную активацию p-ERK (34,5% и 37,1% соответственно) (рис.5d, дополнительный рисунок 9b и таблица 1). В то время как TrkA-Y490AzF не обнаруживал детектируемой активации p-erk во всех условиях, а TrkA-Y670AzF демонстрировал только индуцированную УФ-светом активацию p-ERK в присутствии NGF. Все эти результаты подтверждают, что индуцированная светом активация посредством включения p-erk в AzF или ONB является высокоэффективной в имитации функции NGF в сайтах Y674 и Y675 (рис. 5d, e).

Рис. 5: УФ-свет активирует сигнальный путь MAPK / ERK независимо от лиганда NGF.

Вестерн-блоттинг клеток HEK293T, экспрессирующих wt-TrkA ( a ), мутанты ONB ( b ), включая TrkA-Y490ONB, TrkA-Y670ONB, TrkA-Y674ONB, TrkA-Y675ONB и мутанты AzF d 9033 () в том числе TrkA-Y490AzF, TrkA-Y670AzF, TrkA-Y674AzF, TrkA-Y675AzF; без (-) или с (+) NGF, и без (-), или с (+) УФ-светом.TrkA и β-актин использовали в качестве контроля нагрузки. В отсутствие лиганда NGF, ONB ( c ) или AzF ( e ), включенные в сайты Y674 и Y675 (закрашенные кружки) в TrkA, соответственно, после УФ-обработки инициируют внутриклеточную передачу сигналов MAPK / ERK (стрелки). В случае AzF активация передачи сигналов предположительно происходит из-за фото-перекрестного связывания интерактивного белка в сигнальном комплексе MAPK / ERK. ONB ( c ) или AzF ( e ), включенные в сайты Y490 и Y670 (пустой кружок), не инициируют внутриклеточную передачу сигналов MAPK / ERK (заблокированная стрелка).

Чтобы подтвердить, сшивается ли мутант TrkA AzF с некоторыми белками при УФ-обработке, мы реализуем эксперимент с фото-перекрестным связыванием. Мы протестировали WT-TrkA, TrkA-Y670AzF, TrkA-Y674AzF и TrkA-Y675AzF в присутствии и отсутствии NGF, без УФ и с УФ (дополнительный рис. 12). Для всех условий мономер TrkA можно было обнаружить как характеристическую полосу 180 кДа. Под воздействием УФ-излучения мы наблюдали более высокие молекулярные полосы для мутантов TrkA-Y674AzF и TrkA-Y675AzF (~ 300 кДа) как в условиях + NGF, так и в условиях –NGF, но не в WT или TrkA-Y670AzF.

Экспрессия светочувствительного TrkA в нейрональной клеточной линии SH-SY5Y и контроль дифференцировки нейронов

Наконец, мы попытались протестировать светочувствительные мутанты TrkA в нейронах. Мы решили сначала сконцентрироваться на установлении контроля роста нейритов с помощью света в клетках SH-SY5Y, которые не имеют эндогенного TrkA, который скрыл бы функциональный эффект от мутантного TrkA, а также от световой активации. Для этого мы проверили, могут ли мутанты TrkA-ONB или AzF быть успешно экспрессированы.После временной трансфекции конструкций и добавления в культуральную среду Uaa (1 мМ), обработанного точно так же, как для клеток HEK293 и клеток PC12, мы наблюдали большое количество ярко-зеленых флуоресцентных клеток (дополнительный рис. 7b), которые были отсутствует в элементах управления, где не было добавлено Uaa. Это продемонстрировало правильное генетическое кодирование Uaa посредством спасения янтарного стоп-кодона ортогональной парой тРНК / aaRS. После этого успешного внедрения светочувствительных мутантов TrkA Uaa в клетки SH-SY5Y мы затем стремились оценить рост нейритов при активации каждого тирозина УФ-светом и сравнили их дифференцировку в присутствии и в отсутствие NGF (рис.6). Клетки SH-SY5Y не проецируют нейриты при стимуляции NGF. Однако, когда они экспрессируются с помощью TrkA и обрабатываются NGF, клетки проецируют неврит (дополнительный рис. 7c), который представляет собой процесс, называемый дифференцировкой. Мы приступили к определению, могут ли мутанты TrkA-Uaa достичь аналогичного клеточного результата при стимуляции УФ-светом.

Рис. 6. Мутанты TrkA-ONB и AzF способствуют дифференцировке клеток SH-SY5Y в ответ на УФ-стимуляцию с NGF и без него.

a Репрезентативные флуоресцентные изображения, изображающие клетки SH-SY5Y, экспрессирующие мутанты TrkA-ONB (два столбца слева) или AzF (два столбца справа), включенные в указанные сайты до (-UV) и после (+ UV) обработки со средой, содержащей 100 нг / мл NGF в течение 30 минут, и выдерживанием в темноте в течение 24 часов до визуализации. b Типичные флуоресцентные изображения, изображающие клетки SH-SY5Y, экспрессирующие мутанты TrkA-ONB (два столбца слева) или AzF (два столбца справа), включенные в указанные сайты до (-UV) и после (+ УФ) обработки средой поставляется без NGF. c Коэффициенты дифференцировки были рассчитаны для различных мутантов, экспрессируемых в клетках SH-SY5Y в присутствии NGF с УФ-светом или без него. d Коэффициенты дифференцировки, рассчитанные для клеток SH-SY5Y в отсутствие NGF, экспрессирующего wt-TrkA (WT) или различных мутантов с УФ-светом или без него.Коэффициенты дифференциации рассчитывали, как описано в методе. Значения представляют собой среднее значение ± стандартное отклонение шести биологических повторов ( n = 6) с> 200 клетками, подсчитанными на реплику. Масштабные линейки 10 мкм.

Клетки SH-SY5Y, экспрессирующие wt-TrkA, показали устойчивую дифференцировку при обработке 100 нг / мл NGF, что указывает на то, что экзогенный TrkA сохраняет чувствительность к лигандам и сигнальную активность (дополнительный рис. 7c). УФ-свет существенно не изменил дифференциацию. Для нетрансфицированных клеток дифференцировки не наблюдали.Чтобы определить функциональную роль Y490, Y670, Y674 и Y675 в дифференцировке, мы трансфицировали клетки SH-SY5Y мутантными конструкциями и освещали их в течение 30 минут, как ранее описано для экспериментов вестерн-блоттинга (рис. 6), и сравнили их рост нейритов с WT-TrkA. В присутствии NGF клетки, экспрессирующие Y490ONB, Y674ONB, Y675ONB, Y670AzF и Y675AzF, проявляли значительную УФ-индуцированную дифференцировку по сравнению с необработанным УФ-излучением (коэффициенты дифференцировки: 64,2, 62,8, 53,3, 31,9 и 22.2 соответственно) (рис. 6а, в и дополнительная таблица 2). В отсутствие NGF, Y674ONB, Y675ONB, Y674AzF и Y675AzF демонстрировали УФ-индуцированную дифференцировку по сравнению с необработанным УФ-излучением (коэффициенты дифференциации: 3,9, 3,6, 5,9 и 3,8, соответственно) (рис. 6b, d и дополнительная таблица 2). В целом, существует общее согласие между активностью ERK и дифференцировкой клеток.

Эрк, первая оппозиционная партия Узбекистана, заявляет, что попытается выставить кандидата в президенты

ТАШКЕНТ. Партия «Эрк» (Свобода) в Узбекистане, запрещенная в 1990-х годах, а ее лидер изгнан из страны, а его соратники заключены в тюрьму, заявляет, что планирует попытаться выставить кандидата в президенты на выборах в конце этого года.

Согласно заявлению партии от 5 апреля, два члена партии, Саловат Умрзоков и Джахонгир Отаджонов, официально заявили о своем намерении попытаться стать кандидатом партии на выборах.

Он добавил, что позже ЦК партии решит, кто из кандидатов будет официально выдвинут на голосование, которое намечено на 24 октября.

«Демократическая партия« Эрк », которая в течение 30 лет вела свою деятельность под давлением и преследованиями с тех пор, как стала первой в Узбекистане независимой политической партией, официально зарегистрированной в Министерстве юстиции в 1991 году, решила выдвинуть своего кандидата на предстоящее заседание. президентские выборы «, — говорится в заявлении партии.

В январе 2020 года Министерство юстиции Узбекистана отказалось официально перерегистрировать партию, а министр юстиции Русланбек Давлетов тогда заявил, что «Эрк» «остался в прошлом» и не может возобновить свою деятельность. Маловероятно, что Эрк получит возможность официально баллотироваться на октябрьских выборах.

Известный узбекский поэт Мухаммад Солих, основавший партию, был единственным соперником президенту Исламу Каримову на первых постсоветских выборах в этой центральноазиатской стране в 1991 году.

Независимые наблюдатели заявили в то время, что около 50 процентов избирателей поддержали Солиха, но официальные результаты показали, что он получил только 12 процентов голосов.

Официальные лица на выборах объявили Каримова победителем, что вызвало жестокую разгону студенческой демонстрации. Число погибших студентов пока неизвестно. После репрессий все оппозиционные газеты были закрыты, и были начаты расследования против лидеров оппозиции, которым пришлось бежать из страны.

Солих бежал из Узбекистана в Азербайджан в 1993 году, а затем поселился в Турции, где и проживает с тех пор.

Каримов умер в 2016 году, а его преемник, президент Шавкат Мирзиёев, освобождает политических заключенных в рамках политики постепенного снижения авторитарного контроля в округе.

Мирзиёев с тех пор позиционирует себя как реформатор, открывающий свою страну для своих соседей и внешнего мира, хотя многие активисты говорят, что изменения еще не зашли достаточно далеко.

Хотя Мирзиёев заявил, что не против наличия оппозиционных политических групп в Узбекистане, подлинным оппозиционным партиям было практически невозможно пройти регистрацию с момента обретения страной независимости в конце 1991 года.

На прошлой неделе, за шесть месяцев до выборов и в связи с ростом числа физических нападений на критиков правительства, правительство объявило уголовным преступлением «оскорбление и клевету» на президента в цифровой и онлайн-форме.

Критики говорят, что этот шаг направлен на то, чтобы заткнуть рот блогерам и другим лицам перед выборами.

Комплект аварийного реагирования — ERK

Indian Springs ERK разработан для использования в широком диапазоне корпусов и компоновок железнодорожных вагонов. Комплект будет работать со стандартными корпусами для хлора, диоксида серы, аммиака и т. Д. Литература: https://www.indiansprings.com/product/erk-c-literature/

ПРИМЕЧАНИЕ: КОРОБКА КОМПЛЕКТА ВКЛЮЧЕНА (НЕ ПОКАЗАНА НА ФОТО)

ERK Характеристики:

• ЗАПАТЕНТОВАННАЯ ЗАЖИМНАЯ ЗАЖИМА — ТЕХНОЛОГИЯ GRIPPER: Позволяет надежно закрепить устройство в любом месте корпуса (корпуса до 38 ″ OD).

• Цельная регулируемая алюминиевая вилка в сборе
• Хомут открывается на расстояние 38 дюймов
• Узел вилки не требует отверстий для портов для крепления
• Узел ярма может быть размещен в любом месте вдоль кольца корпуса
• Не требуется «перемычка» для установки пробоотборного клапана и защитной гильзы
• Три алюминиевых крышки и выпускные клапаны с тефлоновым покрытием, 2 стальных кожуха
• Прокладки из витона и EPDM, изготовленные по индивидуальному заказу
• Все компоненты помещаются в один полиэтиленовый ящик для инструментов
• Работы по сборке вилки с существующими комплектами цистерн на поле

ERK является логическим дополнением к нашим комплектам для аварийного реагирования на хлор A, B и C.Этот комплект имеет более легкую и универсальную конструкцию с зажимными губками, которые можно прикрепить в любом месте на кольце корпуса. Алюминиевые кожухи с тефлоновым покрытием позволяют спасателям легко поднимать ERK на вершину железнодорожных вагонов, содержащих опасные материалы, и безопасно выполнять свою работу.

Из-за ограничений по весу этот товар нельзя заказать онлайн. Пожалуйста, позвоните по телефону 315-635-6101, чтобы разместить заказ.

Включает:

1шт. Хомут в сборе, регулировочный, с зажимными губками (, макс. Внешний диаметр корпуса 38 дюймов, ) — , деталь № 18C

1шт.Капот в сборе (сталь) с выпускным клапаном (20 В): внутренний диаметр 3 дюйма, внутренняя высота 13 дюймов — , деталь № 20A
2 шт. Прокладка формованная EPDM — часть # 20BMV
2шт. Прокладка формованная из витона, — часть # 20BEP

1шт. Узел капота (стальной) с выпускным клапаном (30 В): внутренний диаметр 5-1 / 2 дюйма, внутренняя высота 12 дюймов, — , деталь № 30A
2 шт. Прокладка формованная EPDM7, — часть # 30BEP
2шт. Прокладка формованная из витона, — часть # 30BMV

1шт. Узел кожуха (алюминиевый — с тефлоновым покрытием) с выпускным клапаном (46 В): 6-3 / 4 дюйма (внутренний) x 5-1 / 2IH + 6-1 / 2 дюйма ID x 12 дюймов IH, — , деталь № 46A
2шт.Прокладка формованная EPDM, — арт. № 46BEP
2шт. Прокладка формованная из витона, — часть # 46BMV

1шт. Узел капота (алюминиевый — с тефлоновым покрытием) с выпускным клапаном (54 В): 7-1 / 2 “IL x 6-7 / 8” IW x 9-1 / 2 “IH, — , деталь № 54A
2 шт. Прокладка формованная EPDM, — часть # 54BEP
2шт. Прокладка формованная из витона, — часть # 54BMV

1шт. Узел капота (алюминиевый — с тефлоновым покрытием) с выпускным клапаном (64 В): 7-7 / 8 ”кв. (Внутри) x 10-1 / 4“ IH, — деталь № 64A
2 шт.Прокладка формованная EPDM, — часть # 64BEP
2шт. Прокладка формованная из витона, — часть # 64BMV

1шт. Веревка и карабины (2), — часть # X-1
1шт. Набор торцевых ключей, — арт. # X-2
1шт. Проволочная щетка, — арт. No X-3
1шт. Гаечный ключ, 15 ”, регулируемый, — арт. № X-4
1шт. Молоток, машинист 1-1 / 2 фунта, — деталь # X-5
1шт. Скребок для краски, лезвие 1-1 / 4 дюйма, — арт. № X-6
1 шт. Комплект уплотнений коробки, — деталь # X-7
1шт.Болторез, 18 ”, — арт. № X-8
1шт. Кусачки для проволоки, — арт. # X-9
2шт. Мешок с прокладкой, — арт. # X-10
1шт. Ковш для инструмента и карабин, — , деталь № X-11
Комплект коробки: 17 дюймов в x 19 дюймов x 44 дюйма в длину, — деталь № 151-X

1 шт. Гаечный ключ, вентильный ключ — часть # 200-X

2шт. Буклет с инструкциями, — часть № IX

Размер (в упаковке): 42 ″ x 44 ″ x 36 ″, поддон 255 фунтов (доставка осуществляется через LTL) (нетто 210 фунтов)

Применение антифиброзной фототерапии — Университет Кюсю

TY — JOUR

T1 — Фотопродукт триптофана FICZ активирует опосредованную AHR / MEK / ERK экспрессию MMP1

T2 — Последствия антифибротической фототерапии

AU — Mura Мика

AU — Ямамура, Кадзухико

AU — Хашимото-Хачия, Акико

AU — Tsuji, Gaku

AU — Furue, Masutaka

AU — Mitoma, Chikage

5

Информация о финансировании: Эта работа была частично поддержана грантом (h37-Shokuhin-Shitei-017) на исследования по безопасности пищевых продуктов Министерства здравоохранения, труда и социального обеспечения Японии.

PY — 2018/7

Y1 — 2018/7

N2 — Предпосылки: склеродермия вызывается аберрантной передачей сигналов трансформирующего фактора роста-ß. Распад белков внеклеточного матрикса регулируется матриксными металлопротеиназами (ММП) и тканевыми ингибиторами металлопротеиназ (ТИМП). Ультрафиолетовое (УФ) излучение было средством лечения склеродермии. 6-Формилиндоло [3,2-b] карбазол (FICZ), лиганд эндогенного арилуглеводородного рецептора (AHR), представляет собой метаболит триптофана, образующийся под воздействием УФ-излучения.Тем не менее, не исследовалось, регулирует ли FICZ MMP и TIMP. Цель: выяснить регуляторную роль FICZ в экспрессии MMP и TIMP в нормальных фибробластах кожи человека (NHDF). Методы. Количественная полимеразная цепная реакция в реальном времени была проведена для определения экспрессии MMP или TIMP в NHDF, обработанных FICZ или UVB. Уровни ММП измеряли с помощью иммуноферментного анализа. Действие FICZ на MMP анализировали с использованием AHR-нокдауна NHDF или селективных ингибиторов митоген-активируемых протеинкиназ (MAPK).Фосфорилирование протеинкиназы, связанной с микротрубочками (MEK), и киназы, регулируемой внеклеточными сигналами (ERK), исследовали с помощью вестерн-блоттинга. Результаты: UVB увеличивал уровни мРНК и белка MMP1 и MMP3 в NHDF, тогда как FICZ усиливал уровни MMP1, но не MMP3. Воздействие FICZ на TIMP было незначительным. FICZ увеличивал экспрессию MMP1 AHR-зависимым образом. Индуцированная FICZ повышающая регуляция MMP1 улучшалась с помощью ингибиторов MEK / ERK, тогда как эффекты UVB отменялись с помощью N-концевой киназы c-Jun (JNK) и p38-MAPK, а также ингибиторов MEK / ERK.Фосфорилирование ERK, индуцированное FICZ, зависит от AHR. Заключение: FICZ способствует УФ-опосредованным антифиброзным эффектам через сигнальный путь AHR / MEK / ERK в NHDF. FICZ — потенциальное терапевтическое средство от склеродермии.

AB — Предпосылки: склеродермия вызывается аберрантной передачей сигналов трансформирующего фактора роста β. Распад белков внеклеточного матрикса регулируется матриксными металлопротеиназами (ММП) и тканевыми ингибиторами металлопротеиназ (ТИМП). Ультрафиолетовое (УФ) излучение было средством лечения склеродермии.6-Формилиндоло [3,2-b] карбазол (FICZ), лиганд эндогенного арилуглеводородного рецептора (AHR), представляет собой метаболит триптофана, образующийся под воздействием УФ-излучения. Тем не менее, не исследовалось, регулирует ли FICZ MMP и TIMP. Цель: выяснить регуляторную роль FICZ в экспрессии MMP и TIMP в нормальных фибробластах кожи человека (NHDF). Методы. Количественная полимеразная цепная реакция в реальном времени была проведена для определения экспрессии MMP или TIMP в NHDF, обработанных FICZ или UVB.Уровни ММП измеряли с помощью иммуноферментного анализа. Действие FICZ на MMP анализировали с использованием AHR-нокдауна NHDF или селективных ингибиторов митоген-активируемых протеинкиназ (MAPK). Фосфорилирование протеинкиназы, связанной с микротрубочками (MEK), и киназы, регулируемой внеклеточными сигналами (ERK), исследовали с помощью вестерн-блоттинга. Результаты: UVB увеличивал уровни мРНК и белка MMP1 и MMP3 в NHDF, тогда как FICZ усиливал уровни MMP1, но не MMP3. Воздействие FICZ на TIMP было незначительным.FICZ увеличивал экспрессию MMP1 AHR-зависимым образом. Индуцированная FICZ повышающая регуляция MMP1 улучшалась с помощью ингибиторов MEK / ERK, тогда как эффекты UVB отменялись с помощью N-концевой киназы c-Jun (JNK) и p38-MAPK, а также ингибиторов MEK / ERK. Фосфорилирование ERK, индуцированное FICZ, зависит от AHR. Заключение: FICZ способствует УФ-опосредованным антифиброзным эффектам через сигнальный путь AHR / MEK / ERK в NHDF. FICZ — потенциальное терапевтическое средство от склеродермии.

UR — http: // www.scopus.com/inward/record.url?scp=85046165385&partnerID=8YFLogxK

UR — http://www.scopus.com/inward/citedby.url?scp=85046165385&partnerID=8YFLogxK

64 U2 — 2018.04.010

DO — 10.1016 / j.jdermsci.2018.04.010

M3 — Артикул

C2 — 29703420

AN — SCOPUS: 85046165385

VL — 91

SP — 97

EP — JO — Journal of Dermatological Science

JF — Journal of Dermatological Science

SN — 0923-1811

IS — 1

ER —

Ketels, фото Erk — Charles F.Похоронное бюро и крематорий Снайдера

Предлагает похоронные услуги в Ланкастере, штат Пенсильвания, более 70 лет.

Наши пять похоронных бюро в округе Ланкастер позволяют легко и удобно организовывать мероприятия и оказывать услуги рядом с домом.

• Похоронное бюро Чарльза Ф. Снайдера в центре Ланкастера
• 414 Ист Кинг Стрит
• 717-393-9661
• Чарльз Ф. (Чип) Снайдер-младшийПохоронный директор / супервайзер
• подробнее

• Похоронное бюро Чарльза Ф. Снайдера Лититц Пайк
• 3110 Лититц Пайк
• 717-560-5100
• Чарльз Ф. (Чад) Снайдер, III похоронный директор / супервайзер
• подробнее

• Похоронное бюро Чарльза Ф. Снайдера Миллерсвилл
• 441 North George St.
• 717-872-5041
• Марк Д. Буркхолдер Директор по похоронам / супервайзер
• подробнее

• Похоронное бюро семьи Шпахт-Снайдер, Лититц, Пенсильвания,
• 127 South Broad St.
• 717-626-2317
• Жаклин Адамсон Директор по похоронам / супервайзер
• подробнее

• Похоронное бюро и крематорий Бахмана-Снайдера Страсбург, Пенсильвания
• ул. Южного Декейтера, 7,
• 717-687-7644
• Норман Т.Mable Похоронный директор / супервайзер
• подробнее

Коллективные волны активности ERK / Akt управляют гомеостазом эпителия, управляя выживанием, вызванным апоптозом

Введение

Эпителий — это самоорганизующаяся ткань, которая координирует деление и гибель клеток для поддержания своей барьерной функции. Эта способность, называемая эпителиальным гомеостазом (EH), особенно важна из-за частого апоптоза, наблюдаемого в множественных эпителиях, который может привести к полному обновлению тканей в эпителии кишечника за несколько дней (Darwich et al.2014). EH использует преимущества поведения, такие как восприятие плотности клеток, экструзии эпителия, ориентации веретена, коммуникации апоптоза с соседями и динамики межклеточной адгезии для поддержания барьерной функции и целостности эпителия (Macara et al. 2014). Координация между экструзией эпителия и делением клеток имеет решающее значение для поддержания адекватной плотности клеток (Marinari et al. 2012; Gudipaty et al. 2017; Eisenhoffer et al. 2012). Координация апоптотических клеток со здоровыми соседними клетками способствует целостности эпителия, закрывая промежутки, возникающие в результате экструзии умирающих клеток (Gagliardi et al.2018; Gu et al. 2011). Апоптоз может контролировать судьбу соседних клеток. Митогенные факторы, продуцируемые апоптотическими клетками, вызывают пролиферацию в соседних клетках, обеспечивая заживление ран (Li et al. 2010). Апоптозные клетки могут, однако, также индуцировать дальнейший апоптоз в соседних клетках во время процессов развития, которые требуют коллективного апоптоза (Pérez-Garijo et al. 2013). Апоптоз может запускать судьбу выживания в окружающих здоровых клетках имагинального диска крыла Drosophila (Bilak et al.2014). Эти различные процессы подразумевают координацию сигнальных путей, которые регулируют судьбу пролиферации, выживания или апоптоза. Однако то, как эти сигнальные пути регулируются на уровне отдельных клеток и как пространственно-временные интегрированные на уровне популяции, остается плохо изученным.

Сигнальные сети митоген-активированной протеинкиназы (MAPK) / ERK-фосфоинозитид-3 (PI3K) / Akt имеют решающее значение для регуляции судьбы клеток. Помимо классической работы, в которой эти пути изучались с использованием усредненных по популяции измерений, недавние доказательства показали, что динамика передачи сигналов ERK / Akt точно настраивает решения о судьбе на уровне отдельных клеток.В эпителиальных клетках дискретные импульсы активности ERK фиксированной амплитуды и длительности наблюдаются на уровне отдельных клеток (Albeck et al. 2013). Частота импульсов ERK зависит от концентрации эпидермального фактора роста (EGF), которую испытывают клетки, что дополнительно коррелирует с эффективностью входа в клеточный цикл. Вместе это обеспечивает взаимосвязь между дозой EGF и судьбой пролиферации. Эти импульсы ERK возникают из трехуровневой сетевой структуры Raf / MEK / ERK с отрицательной обратной связью от ERK к Raf (Santos et al.2007; Ryu et al. 2016; Albeck et al. 2013), которые обеспечивают сверхчувствительность и адаптационные свойства для формирования их пульсирующей динамики. Помимо импульсов ERK, импульсы Akt, которые синхронны с последними, наблюдались в эпителиальных клетках (Sampattavanich et al. 2018). Считается, что эти импульсы Akt поддерживают метаболическую стабильность в эпителии (Hung et al. 2017). Помимо взаимосвязи, которая связывает дозу EGF и судьбу пролиферации, мало что известно о том, как ERK / Akt регулирует дополнительные решения судьбы отдельных клеток, такие как выживание или апоптоз, и как последние интегрируются на уровне клеточной популяции, чтобы гарантировать EH.Здесь мы показываем, что в ответ на клеточные инсульты апоптоз запускает волну импульсов активности ERK / Akt, которая радиально распространяется примерно на три слоя здоровых клеток вокруг апоптотических, экструдируемых клеток. Эта сигнальная волна требует EGFR и MMP-зависимой передачи сигналов и действует как пространственный сигнал выживания, который локально защищает клетки от апоптоза в течение 3-4 часов. Такое поведение одной клетки позволяет поддерживать ЭГ на уровне популяции и целостность ткани в ответ на легкие или интенсивные клеточные инсульты.

Результаты

Волны коллективной активности ERK / Akt распространяются от апоптотических клеток в неподвижном нестимулированном эпителии

Для исследования динамики активности одноклеточных ERK / Akt в эпителии мы стабильно трансдуцировали клетки MCF10A гистоном 2B (h3B), ERK-KTR ( Regot et al. 2014) и 1-396 Forkhead box O3 (FoxO3a), помеченный miRFP703 (Щербакова и др., 2016), mTurquoise2 (Goedhart et al. 2012) и mNeonGreen (Shaner et al. 2013), соответственно (рис. S1A. ). Биосенсоры ERK-KTR и FoxO3a соответственно сообщают об активности ERK и Akt отдельных клеток, демонстрируя обратимую транслокацию из ядра в цитозоль при фосфорилировании (рис.S1B, видео S1). Хотя FoxO3a может быть чувствительным к ERK-зависимым входам, было показано, что это незначительно в клетках MCF10A (Sampattavanich et al. 2018). Затем мы разработали конвейер автоматического анализа изображений для сегментации и отслеживания ядер с использованием канала h3B-miRFP703. За этим этапом следует выделение интенсивности цитозольной флуоресценции в ядерную, которая количественно определяет активность ERK / Akt (рис. S1C). Как было показано ранее (Albeck et al.2013; Sampattavanich et al.2018), мы наблюдали, что голодные клетки MCF10A демонстрируют синхронные импульсы активности ERK и Akt, частота которых увеличивается при стимуляции EGF (рис.1А). Амплитуды обоих импульсов ERK / Akt были одинаковыми в присутствии или отсутствии EGF (рис.S1D). Примечательно, что визуальный осмотр (рис. 1B, видео S2), а также пространственная кластеризация сигнальных траекторий на основе их усредненных по времени положений (рис. 1C) показали, что голодные монослои часто отображают скоординированные в пространстве и времени импульсы активности ERK / Akt, приводящие к коллективным сигнальным событиям.

Рисунок 1: Волны ERK / Akt распространяются от апоптотических клеток в голодных монослоях MCF10A.

(A) Траектории активности ERK / Akt, измеренные биосенсорами ERK-KTR-mTurquoise2 и FoxO3a-mNeonGreen в голодных (слева) и обработанных EGF (справа) монослоях MCF10A. Показаны сигнальные траектории соотношения цитозольной / ядерной (C / N) флуоресценции соответствующих биосенсоров. (B) Микрофотографии активности ERK / Akt в монослоях MCF10A. Отдельные ядра имеют цветовую кодировку для соотношений ERK / Akt C / N. Красный контур ограничивает область монослоя, показывающую скоординированные в пространстве и времени импульсы ERK / Akt, в дальнейшем называемые коллективным событием. (C) Пространственная кластеризация траекторий ERK. Тепловые карты с цветовыми кодировками траекторий активности ERK, сгруппированных в соответствии с их относительным усредненным по времени положением, то есть соседние траектории на тепловой карте представляют собой ячейки в одной окрестности. Стрелки указывают на коллективные события активности ERK. (D) Интервальные микрофотографии одной коллективной волны ERK / Akt, исходящей из апоптотической клетки. Показаны изображения ядерного маркера, необработанного сигнала ERK-KTR, C / N ERK-KTR, исходного сигнала FoxO3a и C / N FoxO3a.Сплошными линиями обозначен фронт распространения сигнальной волны. Пунктирные линии обозначают прекращение сигнальной волны. Сигналы C / N с цветовой кодировкой «теплый / холодный» указывают на высокую / низкую активность сигналов. (E) Топология контуров ячеек события, показанного на D. (F) Пространственно-сгруппированные траектории ERK / Akt отдельных ячеек от коллективного события, показанного на D. Траектории упорядочены согласно усредненному по времени расстоянию от апоптотическая клетка. Прямоугольники с левой стороны обозначают слои окрестностей, показанные на E. (G) Время максимальной активности ERK / Akt в соответствии с распределением соседей по отношению к апоптотической клетке. Центральная линия показывает среднее значение. Планки погрешностей представляют собой стандартное отклонение. (H) Распределение числа пульсирующих соседей вокруг различных апоптотических событий. (I) Доля активированных соседей в разных слоях соседства. (J) Отношение C / N максимальных амплитуд ERK-KTR в активированных клетках в различных соседних слоях.Ящичковые диаграммы отображают медианное значение, а также 25-й и 75-й процентили; усы соответствуют максимальному и минимальному значениям. Т-тест между 1-м и 3-м слоями (**, P <0,01). Масштабные линейки: (A) 100 мкм, (D) 50 мкм.

Мы наблюдали, что такие коллективные события запускаются апоптозом, который возникает в результате стресса из-за голодания EGF, и состоят из волны импульсов активности ERK / Akt, которые исходят от апоптотической клетки и радиально распространяются в здоровых соседних клетках (рис. 1D). , Видео S3). Классификация соседних клеток на основе их топологической связи с апоптотической клеткой выявила последовательное срабатывание синхронного импульса активности ERK / Akt в каждом последующем клеточном слое (рис.1E, F). В первом слое активность ERK / Akt увеличивается синхронно с апоптотическим сжатием ядра и достигает пика через 10-15 минут после этого события (Fig. 1G, S1E). Во втором / третьем клеточных слоях задержанная активность ERK / Akt достигает пика через 15-20 и 20-30 минут соответственно. Апоптотическая клетка может запускать коллективную активацию ERK / AKT, которая включает в среднем около 10 соседних клеток (Рис. 1H). Доля соседних клеток с импульсами ERK / Akt резко уменьшается по слоям; примерно 90% клеток активируются в первом, 30% во втором и 10% в третьем слое (рис.1I). Кроме того, хотя амплитуда импульса постоянна в первом и втором слое, мы обнаружили небольшое, но значительное уменьшение амплитуды активности ERK в третьем слое (рис. 1J). Эти результаты показывают, что апоптотические клетки индуцируют радиально распространяющиеся сигнальные волны ERK / Akt в соседних здоровых клетках.

Волны ERK / Akt инициируются во время ранних морфологических событий апоптоза и запускаются независимо от активности каспаз

Выполнение апоптоза связано с прототипной последовательностью морфологических событий, которые включают сжатие ядра, образование пузырей плазматической мембраны, конденсацию хроматина, экструзию апоптотическая клетка, фрагментация ядра и дезагрегация на апоптотические тельца (Saraste and Pulkki 2000).В эпителиальных клетках двум последним событиям обычно предшествует экструзия, которая удаляет апоптотическое тело перед фрагментацией (Rosenblatt et al. 2001; Gagliardi et al. 2018). В клетках MCF10A экструзия, однако, была успешной только в 40% случаев апоптоза, тогда как в 60% случаев образование апоптотических телец происходило внутри монослоя. Начало волн ERK / Akt совпало с сокращением ядра, первым событием в последовательности апоптоза, которое затем использовалось в качестве ориентира для выравнивания коллективных событий (рис.2А, Ж). Другие морфологические признаки апоптоза, включая экструзию эпителия, произошли после появления коллективной сигнальной волны, исключая их как потенциальных инициаторов волны (Fig. 2B-G).

Рисунок 2: Волны ERK / Akt совпадают с ранними морфологическими событиями эпителиального апоптоза и могут быть вызваны оптогенетически индуцированным MOMP.

(A-F) Примеры и количественная оценка морфологических событий апоптоза, связанных с коллективными волнами активности ERK / Akt.(А) Ядерная усадка. Красная линия и серая область представляют собой среднее значение и стандартное отклонение ядерной площади соответственно. (B) Мембранные пузыри. Блебы транслируются в канале ЭРК-КТР. (C) Конденсация хроматина. Стандартное отклонение интенсивности пикселей в каждом ядре в каждом временном кадре использовалось в качестве показателя гранулярности ядерного хроматина. Красная линия и серая область представляют собой среднее значение и стандартное отклонение для нескольких апоптотических событий. (D) Экструзия эпителия. Оптические срезы XZ и XY получали с помощью конфокального микроскопа с вращающимся диском с масляно-иммерсионным объективом 60x.(E) Ядерная фрагментация. Каждая линия представляет количество ядерных фрагментов для одного события апоптоза. (F) Формирование апоптотических тел. Красные стрелки указывают на отдельные апоптотические тельца в канале ERK-KTR. (G) Временное распределение ранних и поздних морфологических событий апоптоза и максимальной активности ERK в 1-м слое соседей. Буквы на левой оси Y соответствуют морфологическим событиям, показанным на панелях A-F. Закрашенные кружки и горизонтальные полосы представляют собой среднее значение и стандартное отклонение соответственно.Синяя линия отображает среднюю активность ERK с 95% доверительным интервалом (оттенок) в первом слое соседей. (H) Мультфильм, представляющий эксперимент OptoBAX: клетки MCF10A, экспрессирующие биосенсор ERK-KTR, редко трансфицировали Cry2-mCherry-BAX и якорем митохондриальной мембраны Tom20-Cib-GFP. При освещении синим светом всего поля OptoBAX связывается с митохондриальной мембраной, вызывая MOMP-зависимый апоптоз. (I) Снимки, показывающие ассоциацию OptoBAX с внешней митохондриальной мембраной в клетке, подвергшейся воздействию синего света. (J) Волна активности ERK, распространяющаяся от индуцированного OptoBAX апоптоза. (K) Волна активности ERK / Akt в присутствии ингибитора панкаспазы zVAD-FMK. (L) Волна активности ERK, вызванная OptoBAX, индуцировала апоптоз в присутствии zVAD-FMK. Масштабные линейки: (A, C) 5 мкм, (B, F) 10 и 5 мкм, (D, E, I) 10 мкм, (J-L) 50 мкм.

Чтобы причинно связать апоптоз с инициированием сигнальной волны, мы использовали OptoBAX, оптогенетический активатор апоптоза, чтобы избирательно индуцировать гибель клеток с разрешением отдельных клеток (Godwin et al.2019). Трансфекция с низкой эффективностью была использована для достижения стохастической экспрессии плазмид, кодирующих Cry2-BAX, и слияние Cib, заякоренных в митохондриях, в монослое (фиг. 2H). Под воздействием синего света Cry2-BAX перемещается в митохондрии и индуцирует проницаемость внешней мембраны митохондрий (MOMP) (рис. 2I), вызывая апоптоз менее чем за час. Из-за спектральных требований биосенсора и исполнительного механизма мы могли отображать только один биосенсор за раз и сосредоточились на ERK-KTR. Мы наблюдали, что индуцированный OptoBAX апоптоз запускал волну ERK, идентичную той, что вызывается спонтанным апоптозом (рис.2J).

Для дальнейшего определения механизмов, запускающих сигнальную волну, мы обрабатывали клетки zVAD-FMK, ингибитором панкаспазы. ZVAD-FMK не предотвращал волны ERK / Akt ни при спонтанном, ни при инициированном OptoBAX апоптозе (рис. 2K, L, S2A-F, видео S5). Кроме того, после обработки zVAD-FMK клетки, запускающие апоптотическую сигнальную волну, по-прежнему демонстрировали независимое от каспаз ядерное сжатие и конденсацию хроматина (рис. S2G, H), но не проявляли зависимой от каспазы экструзии или образования апоптических тел (рис.S2I). Эти эксперименты показывают, что волна ERK / Akt может запускаться с помощью MOMP и коррелирует с начальными морфологическими событиями апоптоза, независимо от активации каспаз.

Волны ERK / Akt запускаются посредством паракринной передачи сигналов EGFR и MMP

Для исследования сигнальных сетей, запускающих пространственные паттерны ERK / Akt, мы обработали голодные монослои различными ингибиторами и оценили способность апоптотических клеток запускать сигнальные волны. Визуальный осмотр апоптотического сжатия ядра использовался в качестве пространственного ориентира для идентификации волн ERK / Akt.Ингибирование отмененных MEK импульсов ERK в сигнальных волнах, запускаемых апоптозом, без какого-либо влияния на импульсы Akt (фиг. 3A, S3A, B, видео S6). Напротив, ингибирование Akt аннулировало волны Akt без какого-либо эффекта на волны ERK (фиг. 3A, S3C, D, видео S6). Эти результаты предполагают, что оба пути независимо активируются вышестоящим сигнальным узлом. Было показано, что паракринная передача сигналов EGFR, которая инициируется MMPs-опосредованным расщеплением лигандов про-EGF, действует в различных эпителиальных системах (Aoki et al.2017; Young et al. 2015). Ингибирование каталитической активности EGFR гефитинибом полностью аннулировало вызванные апоптозом волны ERK / Akt (фиг. 3B, S3E и F, видео S7). Идентичные результаты были получены с ингибированием связывания лиганда и димеризации рецептора с использованием антитела против EGFR цетуксимаба (фиг. 3B, S3G и H, видео S7), а также с опосредованным батимастатом ингибированием MMP (фиг. 3B, S3I и J. , Видео S7). Апоптоз, запускаемый OptoBax, дал идентичные результаты (фиг. 3C, S4A-I). Эти результаты предполагают, что волны ERK / Akt зависят от MMP-опосредованного расщепления про-EGF-лигандов (Dong et al.1999; Айкин и др. 2019) (вкратце на рис. 3D).

Рисунок 3: Волны ERK / Akt включают передачу сигналов EGFR и MMP.

(A) Волны активности ERK или Akt от апоптотических клеток в присутствии ингибитора Akt AZD5363, ингибитора MEK траметиниба или DMSO. Стрелки указывают апоптотические клетки. (B) Активность ERK / Akt вокруг апоптотических клеток в присутствии ингибитора киназы EGFR гефитиниба, антитела против EGFR цетуксимаба, пан-MMPs ингибитора батимастата или DMSO в качестве отрицательного контроля. (C) Активность ERK после индуцированного OptoBAX апоптоза в присутствии гефитиниба, цетуксимаба, батимастата или ДМСО. (D) Рисунок механизма распространения волн активности ERK / Akt: апоптотическая клетка запускает активацию ММП, которые, в свою очередь, расщепляют лиганд про-EGFR. Зрелая форма лиганда затем связывает и активирует EGFR и нижестоящую сигнальную сеть. Масштабная линейка: 50 мкм.

Волны ERK / Akt не регулируют экструзию клеток

Затем мы исследовали функциональное значение вызванных апоптозом волн ERK / Akt. Сначала мы проверили гипотезу о том, что волны ERK / Akt регулируют цитоскелетный процесс экструзии эпителия, который требует тесной координации апоптотической клетки и ее соседей (Gagliardi et al.2018; Rosenblatt et al. 2001). Эта гипотеза может соответствовать существованию волн импульсов ERK, которые регулируют сократимость миозина, чтобы организовать коллективную миграцию клеток (Aoki et al. 2017). В соответствии с нашим наблюдением, что волны ERK / Akt временно перекрываются с экструзией эпителия (Fig. 2G), мы предположили, что подобный ERK-зависимый сократительный механизм может приводить в действие механические силы, участвующие в экструзии и / или закрытии эпителиальной щели. Чтобы проверить эту гипотезу, мы использовали ранее установленный метод (Gagliardi et al.2018), основанный на обнаружении апоптотического мусора, экструдированного в супернатанте, для оценки кумулятивного эффекта экструзии эпителиальной популяции (рис. S5A). Фактор роста и сывороточное голодание использовали для запуска апоптоза и экструзии в монослое. В качестве контроля zVAD-FMK-опосредованное ингибирование каспазы, которое блокирует апоптотическую экструзию (Andrade and Rosenblatt 2011), привело к низкому количеству апоптотических остатков в супернатанте (рис. S5B, C). Однако подавление волн ERK / Akt с помощью ингибиторов MEK, Akt, EGFR и MMPs не блокировало этот процесс (рис.S5D-G). Тот же результат был получен путем прямого наблюдения отдельных событий экструзии (рис. S5H, видео S8). В целом эти результаты предполагают, что EGFR-зависимые волны ERK / Akt не вносят вклад в процессы цитоскелета во время экструзии эпителия.

Запускаемые апоптозом волны ERK / Akt обеспечивают локальные сигналы выживания

Затем мы исследовали, регулируют ли сигнальные волны решения судьбы. Импульсы ERK участвуют в регуляции входа в клеточный цикл в ответ на EGF (Albeck et al.2013). Однако голодные клетки MCF10A почти не размножаются (Ethier and Moorthy, 1991). Учитывая, что передача сигналов ERK и Akt также регулирует выживание (Lu and Xu 2006; Franke et al. 2003), мы предположили, что сигнальные волны обеспечивают локальные сигналы выживания. Чтобы проверить эту гипотезу, мы разработали вычислительные подходы для изучения того, как пространственно-временная регулируемая динамика ERK / Akt может регулировать выживание и судьбы апоптоза на уровне отдельных клеток. Мы ограничили этот анализ сигнализацией ERK, потому что автоматическая идентификация коллективных событий требовала надежных сигналов, таких как генерируемые цифровыми импульсами ERK.Были получены высококачественные траектории ERK с временным разрешением в 1 минуту, а апоптотические события, основанные на ядерной усадке, были аннотированы вручную. Во-первых, мы исследовали, различается ли динамика активности ERK между апоптотическими клетками в течение 6-часового окна до сжатия ядра и случайными неапоптотическими клетками в течение того же периода. Для этой цели мы обучили сверточную нейронную сеть (CNN) с целью отделения апоптотических от неапоптотических клеток на основе активности ERK (рис. 4A, B, подробности см. В разделе «Методы»).Проекция t-распределенного стохастического встраивания соседей (tSNE) функций, управляемых данными, которые научились разделять классы, показала, что апоптотические и неапоптотические траектории ERK группируются на каждом конце пространства tSNE (рис. 4A). Это указывает на то, что различная динамика передачи сигналов позволяет предсказать апоптотические и неапоптотические судьбы. Траектории прототипа, для которых достоверность модели была самой высокой, предполагают, что частота импульсов ERK является наиболее различающим фактором, используемым CNN для разделения апоптотической и неапоптотической судьбы выживания (рис.4Б). Основываясь на этом наблюдении, мы затем запустили алгоритм обнаружения пика на временном ряду и сравнили количество импульсов ERK с судьбой клеток и выходными данными классификации CNN (рис. 4C). Траектории без каких-либо импульсов ERK соответствовали апоптотическим клеткам в ~ 65% случаев. Напротив, около 70% траекторий с 2-5 импульсами и 100% с более чем 5 импульсами соответствовали клеткам, которые не подверглись апоптозу. Траектории с редкими изолированными импульсами ERK нельзя отнести к апоптотической судьбе или судьбе выживания (рис.4Б, В). Эти результаты предполагают, что судьба апоптоза / выживания в голодных монослоях зависит от частоты импульсов ERK.

Рис. 4. Волны ERK управляют AiS.

(A) tSNE проекция латентных признаков, изученных CNN для классификации траекторий передачи сигналов ERK в апоптических и неапоптотических клетках за 6 часов, предшествующих апоптозу. Каждая точка представляет собой сигнальную траекторию, состоящую из одной ячейки. Ромбами выделены прототипные траектории ERK апоптоза (оранжевый), неапоптозный класс (синий) или прогноз с низкой достоверностью (зеленый). (B) Прототип траекторий ERK из A. (C) Распределение траекторий ERK в соответствии с вероятностью апоптоза, предсказанной CNN, по сравнению с количеством импульсов активности ERK в траекториях. Правый график показывает соотношение апоптотических и неапоптотических клеток при каждом подсчете импульсов активности ERK. (D) Автоматическая идентификация событий коллективной активности ERK на основе активности ERK. Черные многоугольники обозначают коллективные события; звездочки — апоптотические события. (E) Тепловые карты активности ERK в апоптотических и неапоптотических клетках, случайно выбранные в той же рамке и поле зрения, что и апоптотическое событие. Оранжевый оверлей указывает время, когда клетки участвуют в коллективных событиях. Белый пунктирный прямоугольник указывает трехчасовое окно до апоптоза. (F) Процент клеток, затронутых коллективными событиями во время окна перед апоптозом. Оранжевая линия соответствует апоптотическим клеткам. Черные линии представляют результат для парных неапоптотических клеток, повторно взятых 1000 раз в том же поле зрения, что и соответствующие апоптотические клетки.Синяя линия — это среднее значение всех пересчитанных кривых. (G) Пример динамики активности ERK в последовательных апоптотических событиях (белые кресты) в первом слое соседей первичного апоптотического события, обозначенного «A». Шкала 20 мкм. (H) ERK сигнальные траектории последовательных апоптотических событий в первом районе из панели G. (I) Классификация первых соседей апоптотических клеток на тех, которые получили или не получили волну активности ERK. (J) Процент вторичных апоптотических событий у первых соседей, которые получили импульс активности ERK в течение 2-часовых интервалов после первичного апоптотического события.Планки погрешностей представляют собой 95% доверительный интервал. Пунктирная линия и заштрихованная серая область представляют процент пульсирующих ячеек у всех первых соседей и 95% доверительный интервал. Значимость в отношении «> 10 часов», рассчитанная с помощью критерия хи-квадрат и скорректированная с помощью метода Холма-Бонферрони (*, P <0,05; **, P <0,01).

Во-вторых, мы оценили, коррелирует ли различная динамика передачи сигналов в апоптотических и неапоптотических клетках с коллективными сигнальными событиями. С этой целью мы разработали вычислительный подход, который автоматически идентифицирует клетки, участвующие в коллективных событиях передачи сигналов ERK-волны (рис.4D, S6A, Video S9, подробности см. В разделе «Методы»). Мы выровняли во времени траектории ERK апоптотических клеток по отношению к апоптотическим событиям и сравнили последние с траекториями неапоптотических клеток, выбранных в том же кадре и поле зрения (рис. 4E). Затем мы визуализировали возникновение коллективных событий ERK на этих траекториях апоптотических и неапоптотических клеток. События коллективной передачи сигналов ERK произошли только в ~ 32% апоптотических траекторий по сравнению с ~ 53% случайно выбранных неапоптотических клеток (рис.4E, F). Более того, события коллективной передачи сигналов ERK были менее многочисленными в течение 3-часового окна перед апоптозом по сравнению с тем же временным окном для случайно выбранных неапоптотических клеток (фиг. 4E). Эти результаты показывают, что клетки, переживающие коллективные события ERK, с меньшей вероятностью погибнут, чем клетки, которые этого не делают. В-третьих, на основе этих результатов мы исследовали, способствует ли локально выживанию импульс ERK в сигнальной волне, запускаемой апоптозом. С этой целью мы оценили историю передачи сигналов «вторичных» апоптотических клеток, расположенных в пределах 1-го слоя соседей первичного апоптотического события (рис.4G-I, Видео S10). Мы обнаружили, что до 4 часов после первичного апоптоза вторичный апоптоз значительно менее вероятен в клетках, которые испытали импульс ERK, вызванный первичным событием (рис. 4J). Это убедительно свидетельствует о том, что импульс активности ERK в сигнальной волне, запускаемой апоптозом, способствует выживанию в течение примерно 4 часов. Мы называем процесс, с помощью которого сигнальные волны, запускаемые апоптозом, локально усиливают выживаемость, выживание, индуцированное апоптозом (AiS).

Судьба выживания модулируется частотой импульсов ERK

Наши результаты предполагают, что критическая частота, по крайней мере, ERK, но потенциально также и импульсов Akt, необходима для обеспечения судьбы выживания в голодных монослоях.Чтобы установить, регулируют ли конкретные динамические сигнальные частоты судьбу выживания, мы использовали две оптогенетические системы, чтобы вызвать синтетические сигнальные импульсные режимы, которые демонстрируют разные частоты. Мы одновременно измерили активность ERK, используя спектрально совместимую версию ERK-KTR с mRuby2-меткой (рис. 5A). Первая система представляет собой рецептор на основе световозбуждаемого фактора роста фибробластов 1 (OptoFGFR), который активирует передачу сигналов ERK и Akt (Kim et al. 2014) и, таким образом, имитирует EGFR-зависимую передачу сигналов, наблюдаемую в нашей клеточной системе.Второй — это световозбудимая конструкция RAF (OptoRAF), которая избирательно контролирует только активность ERK (Aoki et al. 2017). Для обеих систем импульс синего света ² со скоростью 100 мс и 0,3 Вт / см может вызвать устойчивый импульс ERK аналогичной амплитуды (рис. 5B, C, видео S11). Мы индуцировали синтетические импульсные режимы ERK со световой стимуляцией, применяемой каждые 1, 2, 3, 4, 6, 12 часов с обеими оптогенетическими системами в течение 24-часового периода после голодания (рис. 5D). Импульсы ERK были синхронизированы по популяции клеток, и их частота была синхронной с различными режимами стимуляции (рис.5E, G). Оценка скорости апоптоза показала устойчивую выживаемость, когда импульсы ERK запускались по крайней мере каждые 3 часа с помощью OptoFGFR (фиг. 5F, видео S12). Защита от апоптоза была промежуточной, когда импульсы ERK запускались каждые 4 часа и терялись с 6- и 12-часовыми интервалами (фиг. 5F). На уровне клеточной популяции это почти полностью подавляло пик апоптоза, вызванный голоданием (рис. S6B). Ингибирование ERK или Akt отменяет защиту, обеспечиваемую стимуляцией OptoFGFR на высокой частоте (рис.S6C). Аналогичные эффекты наблюдались с OptoRAF, в котором высокие частоты ERK (периодичность импульсов 1, 2, 3, 4 часа) обеспечивали надежную защиту, которая затем постепенно уменьшалась на более низких частотах (рис. 5G, H). При использовании обеих оптогенетических систем импульсов ERK каждые 3-4 часа достаточно для защиты от апоптоза. Наши результаты с использованием OptoFGFR предполагают роль как ERK, так и Akt в передаче сигналов выживания, хотя мы не оценивали динамику передачи сигналов Akt в этой системе. Обнаружение того, что опосредованные OptoRAF импульсы ERK индуцируют выживание при высокой частоте, предполагает, что передачи сигналов ERK достаточно для проявления эффектов, способствующих выживанию.Однако мы также обнаружили, что экспрессия системы OptoRAF в некоторой степени увеличивает выживаемость (сравните базовые уровни выживаемости, рис. 5F по сравнению с 5H), внося небольшую погрешность в нашу систему.

Рисунок 5: Частотная модуляция импульсов ERK регулирует судьбу выживания.

(A) Рисунок двух оптогенетических инструментов, используемых для индукции синтетических импульсных режимов передачи сигналов ERK. OptoFGFR состоит из основанного на CRY2, димеризуемого в синем свете, внутриклеточного домена FGFR1, связанного с плазматической мембраной. OptoRAF состоит из cRAF, слитого с CRY2, и домена CIBN, нацеленного на плазматическую мембрану.Синий свет может привлекать CRAF к плазматической мембране. (B) Примеры активности ERK, запускаемой OptoFGFR и optoRAF. Типичные микрофотографии показывают соотношение C / N ERK-KTR до и после импульса синего света. Шкала 100 мкм. (C) Средние траектории активности ERK от апоптотических соседей или от клеток, экспрессирующих OptoFGFR, и от клеток, экспрессирующих OptoRAF в ответ на синий свет. Заштрихованная область представляет 95% доверительный интервал. Время сжатия ядра для апоптоза и время свечения синим светом для OptoFGFR и OptoRAF соответствуют времени 0. (D) Различные режимы стимуляции синим светом от 1 импульса в час до отсутствия импульсов. (E) Траектории передачи сигналов ERK в клетках, экспрессирующих OptoFGFR, отвечающих на режимы стимуляции в D. (F) Процент апоптотических событий в клетках, экспрессирующих OptoF-GFR, через 24 часа после удаления фактора роста в ответ на режимы стимуляции в D (G , H) То же, что панели E, F, но с использованием клеток, экспрессирующих OptoRAF. Планки погрешностей представляют собой стандартное отклонение 3-х повторных экспериментов.Т-тест по сравнению с нестимулированными клетками (*, P <0,05; **, P <0,01; ***, P <0,001).

AiS обеспечивает поддержание целостности ткани в ответ на стрессы различной интенсивности. реакция на стресс (например, голодание). Чтобы выяснить это, мы оценили скорость апоптоза в ответ на голодание и сравнили ее с усредненными по популяции измерениями активности ERK и Akt (рис.6А). Однослойное голодание приводило к кратковременному пику апоптоза, который начинался через 2-3 часа после голодания и продолжался еще 2-3 часа до тех пор, пока не наступила установившаяся скорость апоптоза. Поразительно, что усредненные по популяции активности ERK / Akt сразу же снижались при голодании и временно повторно активировались с кинетикой, которая была немного задержана относительно скорости апоптоза. Этот результат предполагает, что весь монослой может адаптироваться к стрессу, вызванному голоданием, динамически регулируя выживаемость для поддержания EH и целостности ткани.

Чтобы дать интуитивное представление о том, как AiS регулирует реакции выживания на уровне популяции, мы построили математическую модель, отражающую динамическую взаимосвязь между апоптозом и выживанием. Модель состоит из 2 взаимодействующих компонентов: клеток, подвергающихся апоптозу, и защиты от гибели клеток, которая соответствует усредненной по популяции активности ERK / Akt, запускаемой апоптозом (фиг. 6B). Повышение уровня защиты зависит от скорости апоптоза, которая, в свою очередь, негативно регулируется степенью защиты в системе.Накопление защиты моделируется как многоступенчатый процесс, что способствует задержке в системе. Затем мы варьировали константы скорости апоптоза и активации защиты и рассчитали кратное изменение периода полужизни исходного пула клеток относительно периода полужизни чистого экспоненциального распада, то есть модели без компонента защиты (рис. 6С). Мы исследовали 3 сценария (рис. 6C, D). В сценарии 1 мы устанавливаем низкий уровень апоптоза и высокий уровень активации защиты, чтобы имитировать наш эксперимент с голоданием (рис.6D). Модель соответствовала эксперименту с голоданием (рис. 6А) в том, что за эпизодом повышенного апоптоза следует отсроченная индукция защиты. Затем повышение уровня защиты замедляет скорость апоптоза. Эти чередующиеся периоды защиты и апоптоза проистекают из положительной регуляции, соединенной с отложенной отрицательной регуляцией, и приводят к затухающим колебаниям как уровня защиты, так и скорости апоптоза (рис. 6D).

Рис. 6: AiS поддерживает целостность тканей при нагрузках разной интенсивности.

(A) Скорость апоптотических клеток в час после голодания, наложенная на средние траектории активности ERK / Akt. Заштрихованные области представляют 95% ДИ. (В) Двухкомпонентная модель АиС. Скорость апоптоза вызывает защиту, которая затем подавляет скорость апоптоза. Начало защиты является многоступенчатым, что приводит к задержке ингибирования апоптоза. (C) Исследование пространства параметров модели. Время полураспада исходного пула клеток, рассчитанное как кратное изменение относительно времени полураспада экспоненциального распада без индукции защиты.Изолинии представляют собой период полураспада с изменением в 2-6 раз. Точки указывают на 3 сценария, рассмотренные на следующей панели. (D) Прогнозируемая скорость апоптоза, уровень защиты и количество клеток для 3 сценариев, соответствующих: 1 — голодный необработанный эпителий, 2 — острое проапоптотическое лечение, 3 — острое проапоптотическое лечение и ингибирование AiS. Количество клеток сравнивается с экспоненциальным убыванием без защиты. (E) Скорость апоптотических клеток в час после обработки 5 мкМ доксорубицина, совмещенная со средними траекториями активности ERK и Akt.Заштрихованные области представляют 95% ДИ. (F) Распределение скорости апоптоза клеток в час через 8-20 часов после добавления доксорубицина и в присутствии различных обработок. Ящичковые диаграммы отображают медианное значение, а также 25-й и 75-й процентили; усы соответствуют максимальному и минимальному значениям. (G) Примеры снимков ядерного канала из покадровых экспериментов эпителия MCF10A, обработанного совместно с доксорубицином и другими ингибиторами. Дыры были обнаружены на каналах ERK-KTR и FoxO3a с помощью программного обеспечения Ilastik и представлены в виде черных областей с красными контурами.Шкала 200 мкм. (H) Количественная оценка процента площади, занятой отверстиями, из эксперимента в G. Каждая линия представляет собой среднее значение 4 различных полей зрения. 5% площади, занятой отверстиями, было использовано в качестве контрольной точки времени для создания врезки. Каждая точка представляет собой поле зрения, а горизонтальные линии — среднее значение. D, ДМСО; C, цетуксимаб; G, Гефитиниб; B, Батимастат; Т, траметиниб; А, AZD5363. (I) Корреляция между активностью ERK или Akt и процентом площади, занятой лунками, через 20 часов после добавления доксорубицина.Бриллианты, в среднем; планки погрешностей, стандартное отклонение. (J) Рисунок эффекта AiS в масштабе популяции на эпителий, подверженный низкому или высокому апоптотическому стрессу, по сравнению с тем же эпителием, у которого отсутствует AiS. В присутствии AiS апоптотические события рассредоточены, и эпителий может реагировать на широкий спектр стрессов.

В сценарии 2 мы увеличили скорость апоптоза, который может быть вызван цитотоксическим препаратом. По сравнению с первым сценарием модель предсказывала более высокий уровень защиты и скорость апоптоза после начального переходного процесса (рис.6D верхняя панель). Хотя количество ячеек уменьшается быстрее, чем в сценарии 1, высокий уровень защиты предотвращает гибель ячеек со скоростью чисто экспоненциального распада (рис. 6D, нижняя панель). В сценарии 3 мы поддерживали высокую скорость апоптоза, но снижали степень защиты, что соответствует лечению, которое подавляет защитный эффект (например, ингибирование активности ERK / Akt). Здесь скорость апоптоза демонстрирует гораздо более медленный переходный процесс из-за более слабой защиты (рис. 6D, верхняя панель), что приводит к тому, что количество клеток точно соответствует чисто экспоненциальному спаду (рис.6Г, нижняя панель).

Чтобы экспериментально подтвердить результаты, полученные с помощью математической модели (сценарии 2/3), мы обработали наши клетки доксорубицином, который вызывает апоптоз в результате окислительного стресса в клетках MCF10A (Gajewski et al. 2007). Скрининг доза-ответ выявил 2,5 и 5 мкМ доксорубицина как концентрации, вызывающие сильную гибель клеток (фиг. S7A). Это вызвало резкое увеличение апоптоза от 5 до 7 часов после инкубации с последующим устойчивым уровнем апоптоза, который соответствовал примерно 3-4% популяции клеток в час в течение более 10 часов (рис.S7B). Резкое увеличение апоптоза сопровождалось несколько замедленным увеличением средней активности ERK / Akt в популяции, которая затем оставалась высокой (фиг. 6E, S7C и D, видео S13). Более низкие дозы доксорубицина, которые способствовали низкому апоптозу, приводили только к низкому увеличению ERK / Akt (фиг. S7C и D). Эти результаты соответствуют предсказаниям сценария 2 нашей модели (рис. 6D). Чтобы выяснить, является ли этот устойчивый популяционный уровень ERK / Akt следствием AiS, мы ингибировали EGFR, MMP, ERK или Akt и оценили частоту апоптоза. Хотя любой из этих ингибиторов по отдельности оказывал лишь умеренное влияние на апоптоз, их комбинация с доксорубицином вызвала резкое увеличение скорости апоптоза (рис.6F, S8A и B), как предсказано в сценарии 3 нашей модели (рис. 6D). Чтобы охарактеризовать, как изменения скорости апоптоза влияют на целостность ткани, мы измерили скорость, с которой отверстия формировались в монослое. Мы обнаружили, что комбинации доксорубицин-лекарственные препараты быстро приводят к массивной потере целостности ткани из-за создания отверстий в монослое, которые появляются через ~ 15 часов после лечения лекарственными средствами (рис. 6G и H, видео S14). Через 20 часов после обработки только доксорубицином мы наблюдали только небольшие отверстия, которые составляли максимум 5% поверхности монослоя.Однако после подавления AiS до 40% поверхности содержало дыры (рис. 6H). Кроме того, мы наблюдали обратную корреляцию между усредненными по популяции уровнями активности ERK / Akt и площадью отверстий через 20 часов после обработки доксорубицином (рис. 6I). Эти результаты убедительно свидетельствуют о том, что передача сигналов AiS на одноклеточном уровне вносит вклад в целостность ткани на уровне популяции за счет своей способности реагировать на воздействия различной интенсивности и за счет пространственного разделения участков апоптоза (рис. 6J).

Обсуждение

Эпителиальные ткани постоянно испытывают колеблющиеся стрессы и требуют динамической координации судьбы апоптоза, выживания и пролиферации для поддержания критической плотности клеток для сохранения барьерной функции.Это включает плохо охарактеризованные механизмы, которые позволяют коллективу клеток постоянно ощущать состояние эпителия и динамически реагировать, определяя эти решения судьбы (Macara et al. 2014). Мы сообщаем об AiS, удивительно простом многомасштабном пространственном сигнальном механизме, который сохраняет EH в ответ на стрессы окружающей среды (рис. 6J). На уровне отдельных клеток AiS включает запускаемые апоптозом распространяющиеся волны ERK / Akt, которые защищают окружающие клетки от апоптоза в течение 3-4 часов.На уровне популяции это позволяет клеточному коллективу динамически регулировать уровни выживаемости, чтобы реагировать на стрессы различной интенсивности, например голод или цитотоксический вызов. Кроме того, пространственная природа передачи сигналов AiS гарантирует, что клетки в непосредственной близости не могут одновременно погибнуть (рис. 6J), что дополнительно способствует целостности ткани даже в ответ на сильный стресс из-за цитотоксического препарата.

Механизм распространения волны импульсов ERK / Akt

Важный вопрос заключается в том, как эта волна ERK / Akt пространственно регулируется.Мы обнаружили, что это зависит от канонической передачи сигналов EGFR, которая последовательно запускает радиально распространяющиеся импульсы ERK / Akt (Рис. 3D). Требование активности ММП исключает простую диффузию лиганда EGFR из апоптотической клетки. Скорее, расщепление связанных с мембраной лигандов-предшественников EGFR, таких как EGF или amphiregulin (Dong et al. 1999), может активировать передачу сигналов в соседних клетках. Это может вызвать запускающую волну, в которой каждый уровень ячейки последовательно активирует следующий уровень ячейки посредством передачи сигналов EGFR / MMP.

Соответственно, сходные EGFR / MMP-зависимые волны ERK контролируют миозин-зависимую сократимость, чтобы организовать коллективную миграцию эпителиальных клеток в клетках Madin-Darby Canine Kidney (MDCK) (Aoki et al.2017; Hino et al.2020). Важно отметить, что клетки MDCK также продуцируют волны ERK, запускаемые апоптозом (Aoki et al. 2013). Вместе эти результаты предполагают, что EGFR / MMP-зависимые волны ERK / Akt могут быть эволюционно консервативным сигнальным путем, который может функционировать в регуляции таких процессов, как коллективная миграция клеток и AiS-зависимая EH.

Другим важным фактором, формирующим сигнальную волну, является нелинейный характер каскада MAPK (Birtwistle and Kolch 2011). Каскад Raf / MEK / ERK проявляет сверхчувствительность и адаптацию (Santos et al. 2007; Ryu et al. 2015; Sparta et al. 2015), что позволяет производить короткие импульсы ERK полной амплитуды даже при низком входном EGFR. Обнаружение того, что количество клеток, которые демонстрируют цифровые импульсы ERK, уменьшается в последовательных слоях сигнальной волны (рис. 1I), предполагает, что каскад EGFR / MAPK работает на пороговом входе, необходимом для производства ответов ERK по принципу « все или ничего ».Это согласуется с небольшими количествами EGFR-лиганда, которые могут высвобождаться посредством протеолиза, опосредованного MMP. Таким образом, наблюдаемая досягаемость сигнальной волны, которая охватывает до ~ 4 слоев вокруг апоптотического события, может происходить из архитектуры сети MAPK. Подобная сетевая логика может создавать переходные процессы Akt ниже EGFR. Однако, учитывая, что обратная связь в передаче сигналов PI3K была менее хорошо охарактеризована, трудно выдвинуть гипотезу о механизмах, лежащих в основе импульсов Akt.

Регулирование судьбы с помощью частоты импульсов ERK / Akt

Импульсы ERK / Akt, запускаемые стимуляцией EGF и апоптозом, имеют очень похожие амплитуды (рис.1A, B, S1D), и они практически неотличимы при сравнении вне их пространственного контекста. Наши результаты показывают, что очень низкая частота импульсов ERK / Akt коррелирует с апоптозом, тогда как более высокая частота импульсов способствует выживанию (рис. 4A-C). В ответ на стимуляцию EGF, которая ведет к даже более высоким частотам сигнальных импульсов, чем в голодных монослоях, решение о судьбе входа в клеточный цикл напрямую коррелирует с зависимым от концентрации EGF контролем частоты импульсов ERK (Albeck et al. 2013). Это предполагает, что существует три различных режима частоты пульса ERK / Akt, которые коррелируют с апоптозом, выживаемостью и размножением.В самом деле, в нативных тканях, где клетки постоянно испытывают факторы роста и клеточные стрессы, комбинаторный контроль импульсов ERK / Akt, исходящих из событий апоптоза или факторов роста, может тонко настраивать EH, в равной степени внося свой вклад в судьбы выживания / пролиферации.

Непосредственный вопрос заключается в том, как клетка интерпретирует частоту передачи сигналов ERK / Akt в этих конкретных судьбах. Несколько известных субстратов ERK или Akt вовлечены в прямое срабатывание выживания, например, субстрат Akt BAD (Datta et al.1997) или субстрат ERK BIM (Harada et al. 2004). Учитывая, что активность фосфатазы в отношении этих субстратов ERK / Akt может быть постоянной, мы предполагаем, что эффект выживания из-за фосфорилирования этих субстратов прямого исполнительного механизма может быть кратковременным, позволяя коллективу клеток постоянно сбрасывать свою судьбу выживания, чтобы оставаться реагирует на будущие стимулы апоптоза или факторов роста. Другой механизм решения судьбы может действительно включать ERK / Akt-зависимый контроль транскрипционных программ, которые эволюционировали, чтобы работать во временных масштабах, совместимых с AiS (Avraham and Yarden 2011).В случае ERK это включает в себя гены немедленного ранга (IEG), которые продуцируют крайне нестабильные транскрипты со временем жизни 30-40 минут, которые, в свою очередь, регулируют транскрипцию отложенных ранних генов (DEG) со временем жизни 1-3 часа. Таким образом, один цифровой импульс ERK / Akt может включать экспрессию гена, которая колеблется в масштабе времени, в котором возникает AiS, снова позволяя коллективу клеток изменить свою судьбу выживания и оставаться отзывчивой на будущие стимулы. Более высокие частоты передачи сигналов, наблюдаемые в ответ на стимуляцию EGF, могут затем позволить контролировать судьбу пролиферации посредством регуляции IEG, таких как Fra-1, которые могут линейно интегрировать активность ERK с течением времени (Gillies et al.2017). В будущем оптогенетическая индукция синтетических частотно-модулированных сигнальных режимов может расшифровать то, как решения о судьбе контролируются частотой сигнальных импульсов. Другая возможная функция импульсов Akt м. Быть одноклеточной регуляцией метаболической активности, необходимой для обеспечения принятия конкретных решений судьбы (Hung et al. 2017). Наконец, мы предполагаем, что импульсы ERK, которые регулируют сократимость миозина во временных масштабах минут, чтобы координировать коллективную миграцию клеток (Aoki et al., 2017; Hino et al.2020) может также регулировать решения судьбы, такие как выживание в часах. Т.о., путь MAPK может функционировать интегративным образом, регулируя процессы в разных временных масштабах, чтобы координировать как цитоскелет, так и ответы выживания / пролиферации во время морфогенетических процессов.

AiS-ответы на уровне популяции

Наши эксперименты и компьютерное моделирование показывают, что при индукции апоптоза, например, Благодаря голоданию или цитотоксическим препаратам обратная связь, встроенная в AiS, позволяет эпителию динамически адаптироваться к разным скоростям апоптоза.Это может помочь смягчить острые всплески скорости апоптоза, которые потенциально могут поставить под угрозу целостность эпителия, и достичь новой стабильной скорости апоптоза, совместимой с регенеративной способностью эпителиальной ткани. Учитывая наблюдение, что апоптотические клетки продуцируют промитогенные факторы (Ryoo et al. 2004; Li et al. 2010), комбинированное действие AiS и пролиферации может поддерживать EH также при высоком стрессе. Например, в наших экспериментах с доксорубицином мы наблюдаем примерно 3% умирающих клеток в час.Учитывая 24-часовой клеточный цикл в клетках MCF10A, который приводит к увеличению популяции на ~ 4% в час, наблюдаемая нами скорость апоптоза может быть достаточной для поддержания устойчивого баланса между пролиферацией и смертью. Наше механистическое объяснение того, как ингибирование передачи сигналов EGFR-ERK / Akt вместе с цитотоксическим препаратом ставит под угрозу EH и целостность ткани, согласуется с многочисленными сообщениями, в которых таргетная терапия повышает чувствительность раковых клеток к химиотерапевтическим агентам (Holt et al.2012; Smolensky et al.2017; Barbuti et al. 2019). Это дает основание для тестирования дополнительных таргетных / цитотоксических комбинированных терапий для получения лучших терапевтических ответов при раке.

Физиологическое значение передачи сигналов AiS

Необходимы дальнейшие исследования, чтобы понять масштабы и значение AiS in vivo . Подобные волны активности ERK также наблюдались in vivo в эпителии мышей (Hiratsuka et al. 2015), предполагая, что наша модель клеточной культуры точно воспроизводит физиологически значимый контекст.Здесь волны активности ERK коррелируют с прогрессией клеточного цикла G2 / M, но вполне возможно, что дополнительные входы, отсутствующие в нашей голодной монослойной системе, контролируют это конкретное решение судьбы. Недавно Valon и др. (Valon et al. 2020) сообщили о запускаемых апоптозом, EGFR-зависимых импульсах ERK во время развития куколки Drosophila. Это может служить механизмом обеспечения устойчивости к внешним воздействиям во время разработки. Поразительное сходство между этими различными системами предполагает, что AiS является высококонсервативным механизмом, регулирующим целостность эпителиальной ткани во всем царстве животных.

Материалы и методы

Культура клеток и реагенты

Клетки MCF10A культивировали в среде роста, состоящей из DMEM: F12 с добавлением 5% лошадиной сыворотки, 20 нг / мл рекомбинантного EGF человека (Peprotech), 10 мкг / мл инсулина (Sigma -Aldrich / Merck), 0,5 мг / мл гидрокортизона (Sigma-Aldrich / Merck), 200 Ед / мл пенициллина и 200 мкг / мл стрептомицина. Все эксперименты проводились в среде голодания, состоящей из DMEM: F12 с добавлением 0,3% БСА (Sigma-Aldrich / Merck), 0,5 мг / мл гидрокортизона (Sigma-Aldrich / Merck), 200 Ед / мл пенициллина и 200 мкг / мл. стрептомицин.Эксперименты с фактором роста и голоданием сыворотки проводили путем удаления ростовой среды, 2 промываний в PBS и замены средой голодания. Трансфекцию клеток MCF10A проводили FuGene (Promega) в соответствии с протоколом производителя. Стабильные клоны с различными биосенсорами / оптогенетическими инструментами были получены путем выбора антибиотиков и скрининга на основе изображений. AZD5363 (Selleck Chemicals), батимастат (MedChem Express), доксорубицин (MedChem Express), гефитиниб (Sigma-Aldrich / Merck), SCH772984 (MedChem Express), траметиниб (Selleck Chemicals) и zVAD-FMK (UBPBMSO) растворяли в D хранить при -20 ° C небольшими аликвотами, чтобы избежать циклов размораживания-замораживания.Цетуксимаб был приобретен в MedChem Express.

Плазмиды

Стабильный ядерный маркер h3B-miRFP703 был получен путем слияния CDS кластерного гистона 11 (h3BC11) Homo sapiens h3B с мономерным CDS флуоресцентного белка ближнего инфракрасного диапазона miRFP703 (Щербакова и др., 2016). ERK-KTR-mTurquoiose2 и ERK-KTR-mRuby2 были созданы путем слияния CDS репортера транслокации киназы ERK (ERK-KTR) (Regot et al. 2014) с mTurquoiose2 (Goedhart et al. 2012) и mRuby2 (Lam et al. 2012) ) CDS соответственно.FoxO3a-mNeonGreen был создан путем слияния 1-1188 части CDS forkhead box O3 a (FoxO3a) homo sapiens с CDS mNeonGreen, зеленым флуоресцентным белком, полученным из Branchiostoma lanceolatum (Shaner et al. 2013). h3B-miRFP703, ERK-KTR-mTurquoiose2, ERK-KTR-mRuby2 и FoxO3a-mNeongreen были клонированы в плазмидах PiggyBac pMP-PB, pSB-HPB (подарок Дэвида Хакера, Лозанна, (Balasubramanian et al., 2016)) pPB3.0.Blast, улучшенная плазмида PiggyBac, созданная в нашей лаборатории. Для стабильной интеграции ДНК мы трансфицировали плазмиды PiggyBac вместе с вспомогательной плазмидой, экспрессирующей транспозазу (Yusa et al.2011).

Оптогенетический привод MOMP Cry2 (1–531) .L348F.mCh.BAX.S184E и Tom20.CIB.GFP, первоначально обозначенный как система OptoBAX 2.0, а здесь обозначенный как OptoBAX, был создан Робертом М. Хьюзом (Godwin et al. др.2019). Lyn-cytoFGFR1-PHR-mCit, экспрессирующий миристоилированный цитоплазматический участок FGFR1, слитый с доменом PHR криптохрома 2 и mCitrine, здесь определяемый как OptoFGFR, был подарком от Won Do Heo (плазмида Addgene # 59776) (Kim et al. 2014). Lyn-cytoFGFR1-PHR-mCit субклонировали в лентивирусном скелете для получения стабильной клеточной линии.pPB3.0-PuroCRY2-cRAF-mCitrine-P2A-CIBN-KrasCT, здесь определяемая как OptoRAF, была создана как улучшение ранее описанной системы активации светоиндуцированной ERK, подаренной Казухиро Аоки (Aoki et al., 2017). Клонирование было выполнено в два этапа. Сначала последовательность CRY2-cRaf была вырезана из плазмиды pCX4puro-CRY2-cRAF с использованием EcoRI и NotI. mCitrine амплифицировали с помощью ПЦР из плазмиды OptoFGFR, добавляя сайты NotI и XhoI, и расщепляли. Обе последовательности были лигированы в pPB3.0-Puro, открытый с помощью EcoRI и XhoI.Последовательность GSGP2A-CIBN-KRasCT (синтезированная GENWIZ) расщепляли BsrGI и AflII и лигировали в открытый pPB3.0-Puro-CRY2-cRAF-mCitrine.

Live imaging

клеток MCF10A высевали на 5 мкг / мл фибронектина (PanReac AppliChem) на 24-луночные планшеты с 1,5 стеклянным дном (Cellvis) при плотности 1 × 10 ⁵ клеток / лунку за два дня до эксперимента. Эксперименты по визуализации проводили на эпифлуоресцентном инвертированном флуоресцентном микроскопе Eclipse Ti (Nikon), контролируемом NIS-Elements (Nikon), с Plan Apo air 20 × (NA 0.8) или объективы Plan Apo air 40 × (NA 0,9). Во всех экспериментах использовалась лазерная автофокусировка. Получение изображений производилось камерой Andor Zyla 4.2 plus с глубиной 16 бит. Были использованы следующие фильтры возбуждения и излучения (Chroma): дальний красный: 640 нм, ET705 / 72 м; красный: 555 нм, ET652 / 60 м; NeonGreen: 508 нм, ET605 / 52; GFP: 470 нм, ET525 / 36 м; mTurquoise2: 440 нм, HQ480 / 40.

Оптогенетические эксперименты

Клетки, экспрессирующие OptoBAX, OptoFGFR или OptoRAF, хранили в темноте не менее 24 часов перед экспериментами, и все подготовительные настройки микроскопа проводились с красным или зеленым светом (длина волны> 550 нм).В случае OptoBAX клетки, экспрессирующие h3B-miRFP703 и ERK-KTR-mTurquoise2, трансфицировали плазмидами OptoBAX за день до эксперимента для получения редких трансфицированных клеток (<1% от общей популяции клеток) в эпителии MCF10A. Клетки, экспрессирующие систему OptoBAX, были идентифицированы по экспрессии слитого белка Cry2 (1–531) .L348F.mCh.BAX.S184E, который содержит mCherry. Для эксперимента были выбраны поля зрения, содержащие конфлюэнтные монослои и не более 1-2 клеток OptoBAX.Клетки освещали синим светом всего поля при 440 нм каждые две минуты на протяжении всего эксперимента как для индукции транслокации BAX в митохондрии, так и для изображения ERK-KTR-mTurquoise2. Дополнительно клетки освещали при 508 нм для визуализации Tom20.CIB.GFP, 555 нм для mCherry (слитый белок BAX) и 640 нм h3B-miRFP703. В случаях OptoFGFR или OptoRAF клетки, экспрессирующие h3B-miRFP703 и ERK-KTR-mRuby2, инфицировали лентивирусным вектором, экспрессирующим Lyn-cytoFGFR1-PHR-mCit, или трансфицировали pPB3.2, если этого требует протокол эксперимента. Эксперименты по стимуляции контролировались Джобсами НИШ.

Конвейер анализа изображений

Для ядерной сегментации мы использовали классификатор случайного леса, основанный на различных функциях пикселей, доступных в программном обеспечении Ilastik (Berg et al., 2019). На этапе обучения мы вручную аннотировали ядерные (в 20-50 ячейках) и фоновые пиксели в 16-битных покадровых TIF-изображениях ядерного канала (h3B-miRFP703). Затем карта вероятности ядер была экспортирована в виде 32-битных изображений TIF для выполнения сегментации на основе пороговых значений с помощью CellProfiler 3.0 (Маккуин и др., 2018). Расширение ядерных объектов на заранее определенное количество пикселей использовалось для идентификации области, соответствующей цитоплазме, для каждой клетки, как описано ранее (Pargett et al., 2017). Отношение цитозоль / ядро ​​рассчитывали путем деления средней интенсивности цитозольного пикселя на среднюю интенсивность ядерного пикселя. Для визуализации и контроля качества были созданы изображения сегментированных ядер с цветовой кодировкой согласно ERK-KTR C / N. Отслеживание отдельных клеток выполнялось на ядерных центроидах в MATLAB с использованием μ-track 2.2.1 (Jaqaman et al. 2008). Дыры в эпителиальном слое были идентифицированы с использованием подхода машинного обучения Ilastik, начиная с ручного аннотирования отверстий в комбинированном канале ERK-KTR-mTurquoiose2 FoxO3a-mNeonGreen. После сегментации вероятности отверстий была рассчитана их общая площадь в каждом кадре и поле зрения с Фиджи.

Экструзионный анализ

Клетки MCF10A высевали в 6-луночные планшеты (TPP Techno Plastic Products AG) по 4 × 10 ⁵ клеток и выращивали в течение 3-4 дней до достижения гомеостатического конфлюэнтного состояния.Накануне вечером лунки дважды промывали DMEM: F12, 0,3% БСА, 0,5 мг / мл гидрокортизона, 200 Ед / мл пенициллина и 200 мкг / мл стрептомицина. Через 16 часов суспендированный материал, включая обломки клеток, собирали, концентрировали и окрашивали в течение 10 минут с помощью Hoechst и CellMask orange (Thermo Fisher). Окрашенные частицы помещали между двумя покровными стеклами и получали с помощью широкопольного флуоресцентного микроскопа с 20-кратным объективом. Частицы сегментировали с помощью CellProfiler 3.0, а данные анализировали с помощью R.

Анализ данных

Для анализа и визуализации временных рядов активности ERK / Akt отдельных ячеек мы написали набор пользовательских кодов R / Python. Все записные книжки R с кодом, необходимым для воспроизведения графиков и лежащих в основе данных, доступны в качестве дополнительной информации (ссылка на онлайн-репозиторий: http://dx.doi.org/10.17632/kd3n5k784m).

Сверточная нейронная сеть (CNN)

Сверточная нейронная сеть (CNN) была обучена как бинарный классификатор, который различает апоптотические и неапоптотические клетки на основе их временного ряда активности ERK.Они взяты из четырех экспериментов, в которых активность ERK в клетках MCF10A измерялась каждую минуту. Мы вручную аннотировали апоптотические клетки путем визуального осмотра фильмов и получили 448 временных рядов продолжительностью 8 часов до сокращения ядра. Чтобы создать сбалансированный набор данных и избежать систематической ошибки классификации в отношении любого из классов, мы выбрали 448 случайных временных рядов равной продолжительности с клетками, которые не подверглись апоптозу. Мы выполнили этап увеличения данных, взяв случайные 6-часовые сегменты в каждую тренировочную эпоху анализа CNN.Мы выбрали простую архитектуру CNN, как описано ранее (Zhou et al., 2016). Он состоит из нескольких слоев свертки, за которыми следует глобальный средний пул (GAP), и полностью связанный слой непосредственно перед выходным слоем. Преимущества этой архитектуры — небольшое количество параметров и сильный противовес переоборудования с уровнем GAP. Архитектура включает 6 последовательных одномерных сверточных слоев, все из которых состоят из 20 фильтров, за исключением последнего слоя с 7 фильтрами. На этих уровнях размеры ядра свертки равны (5, 5, 5, 5, 3, 3), соответственно, с шагом 1 и заполнением, которое обеспечивает постоянный размер входного представления во всей сети.За каждым сверточным слоем следует пакетная нормализация и активация ReLU. Весь набор данных (наборы для обучения и проверки) был передан через сеть один раз, и представление временных рядов после того, как слой GAP был спроецирован в 2D с помощью tSNE (рис. 4A). Временные ряды, которые максимизировали достоверность модели для данного класса, были представлены как прототипы. Временные ряды, для которых энтропия выходных данных классификации была максимальной ( i . e . Модель возвращает почти 50% достоверность для обоих классов), были представлены как прототипы с низкой достоверностью.

Обнаружение пиков

Количество пиков активности ERK (рис. 4C) было рассчитано с помощью специального алгоритма, который обнаруживает локальные максимумы во временных рядах. Сначала мы применили короткий медианный фильтр, чтобы сгладить данные. Затем мы запустили длинный медианный фильтр для оценки долгосрочного смещения, которое затем вычли из сглаженного временного ряда. Мы сохранили только положительные значения. Затем эти сглаженные временные ряды без тренда были масштабированы до [0,1]. Наконец, пики были обнаружены как точки, превышающие порог, который мы вручную установили на 0.15.

Идентификация коллективных событий

Чтобы оценить пространственные корреляции в активности ERK, для каждого поля зрения и покадрового кадра мы вычислили локальные индикаторы пространственной ассоциации (Anselin 1995), используя функцию lisa из Пакет ncf доступен для R. Функция принимает значение интенсивности флуоресценции ERK-KTR C / N и положения X / Y центроида ядра. Затем он выводит коэффициент автокорреляции Морана I для ячеек в пределах радиуса, который мы установили на 100 пикселей, и двустороннее p-значение перестановки для каждого наблюдения на основе 1000 повторных выборок.После определения пороговых значений ячеек для корреляции> 0,5 и значения p <0,05 мы применили алгоритм dbscan из пакета R dbscan для идентификации кластеров коллективной активности ERK. Мы предположили, что коллективное мероприятие состоит как минимум из 3 ячеек с максимальным расстоянием между ячейками 100 пикселей. Эта процедура давала индивидуальные коллективные события в каждом кадре замедленного видео. Мы выбрали только те коллективные мероприятия, где ERK-KTR C / N был выше порога. Чтобы оценить порог, мы выполнили кластеризацию k-средних с 2 центрами на отдельных значениях ERK-KTR C / N из всех коллективных событий.Порог был средней точкой между двумя центрами кластеров. Фильмы ядер с цветовой кодировкой согласно ERK-KTR C / N с коллективными событиями, обозначенными выпуклыми многоугольниками, были подготовлены с помощью программы ffmpeg из отдельных файлов png, созданных ggplot2 в сценариях R.

Анализ истории ячеек

Мы сопоставили координаты X / Y / T вручную аннотированных апоптотических событий с временными рядами с одной ячейкой, используя функцию distance_join из пакета fuzzyjoin для R.Используя максимальное евклидово расстояние 10 пикселей, мы автоматически сопоставили около 95% апоптотических событий. Для дальнейшего анализа мы выбрали только временные ряды длиннее 6 часов. Чтобы построить упорядоченные тепловые карты на рис. 4E, мы наложили примеры коллективных событий на временные ряды C / N ERK-KTR отдельных клеток, подвергшихся апоптозу. В качестве отрицательного контроля для каждого события апоптоза мы выбрали случайную клетку из того же периода времени, которая не подвергалась апоптозу в течение всего эксперимента. Мы сравнивали только участки временных рядов, которые соответствовали времени жизни апоптотических клеток.Чтобы рассчитать средний процент неапоптотических клеток, затронутых коллективными событиями в течение временного окна до апоптоза соответствующей апоптотической клетки (рис. 4F), мы повторили выбор случайных неапоптотических клеток 1000 раз.

Математическая модель

Набор уравнений ODE был решен численно с использованием функции ode из пакета deSolve в R.