Ген spitz необходим для определения фоторецепторов.Анализ мозаики предполагает, что шпиц производит диффузный сигнал во время омматидального развития. Ромбовидный, еще один член группы шпицев и рецептор EGF, также взаимодействует с семимес-ромбовидным по схеме, которая предполагает модель, в которой ромбовидный член действует как медиатор взаимодействия лиганд-рецептор между шпицами и Egfr в ​​развивающемся глазу. Эти данные предполагают, что фоторецепторы, отличные от R7, используют путь передачи сигналов Ras1, активируемый взаимодействием Spitz / Egfr, аналогично пути Ras1, активируемому Boss / Sevenless в фоторецепторе R7 (Freeman, 1994).

Ромбовидный ген (rho) , который кодирует трансмембранный белок, является членом небольшой группы генов (вентролатеральных генов), необходимых для дифференцировки вентрального эпидермиса у эмбриона дрозофилы. rho является единственным членом вентролатеральных генов, экспрессируемых по локализованному паттерну, соответствующему клеткам, требующим активности вентролатерального пути. Пространственная локализация rho играет аналогичную роль в установлении рисунка жилок на крыле взрослых особей.Эктопическая экспрессия rho во время развития крыла приводит к образованию дополнительных жилок. Исследования дозировки генов среди вентролатеральных генов предполагают, что RHO может способствовать передаче сигналов Spitz-EGF-R, приводя к активации RAS (Sturtevant, 1993).

Пространственно ограниченная обработка шпица может быть ответственна за активацию с градацией EGF-R. На основе генетических взаимодействий было высказано предположение, что белки Rhomboid (Rho) и Star действуют как модуляторы передачи сигналов EGF-R.Никаких изменений в аутофосфорилировании EGF-R или паттерна активации киназы MAP секретируемым шпицем не наблюдается, когда белки Rho и Star коэкспрессируются с EGF-R в клетках S2. Вентрализующий эффект секретируемого шпица является эпистатическим у эмбрионов, мутантных по rho или Star , что позволяет предположить, что Rho и Star обычно могут способствовать процессингу предшественника шпица (Schweitzer, 1995).

Активация рецептора эпидермального фактора роста дрозофилы (Egfr) трансмембранным лигандом Spitz (Spi) требует двух дополнительных трансмембранные белки: ромбовидные и звездчатые.Генетические данные свидетельствуют о том, что ромбовидные и звездчатые формы способствуют передаче сигналов Egfr путем обработки мембраносвязанный Spi (mSpi) в активную растворимую форму. Для проверки этой модели был использован анализ, основанный на эксплантатах кепки животных Xenopus. Какая Spi-активация Egfr является как ромбовидной, так и звездной. Spi находится на поверхности клетки, но остается в неактивном состоянии за счет его цитоплазматический и трансмембранный домены; Ромбовидная форма и звезда снимают это торможение, позволяя Spi сигнализировать. Spi — это вероятно, будет расщепляться в его трансмембранном домене.Однако мутантная форма mSpi, которая не расщепляется, по-прежнему передает сигнал Egfr в ​​ромбовидной и звездообразной форме. манера. Эти результаты убедительно свидетельствуют о том, что ромбовидная форма и звезда действуют в первую очередь, чтобы представить активную форму Spi для Egfr, что во вторую очередь приводит к переработке Spi в секретная форма (Bang, 2000).

Ромбовидная и Star-опосредованная передача сигналов Egfr была проанализирована с помощью анализа в какие эксплантаты колпачка Xenopus были выделены из эмбрионов инъецировали синтезированный in vitro Egfr, spi , МРНК rhomboid и Star .Этот анализ основан на на том факте, что Egfr активирует путь Ras, что должно привести к повышающая регуляция экспрессии гена-мишени Ras Xenopus Брачуры ( XBra ) в звериных шапках. Крышки животных из инъецированных эмбрионов позволяли развиваться до брата или сестры. эмбрионы были поздними гаструлами (стадия 11.5), когда их анализировали на Экспрессия XBra с помощью анализа защиты от РНКаз (RPA). Экспрессия XBra может быть индуцирована в шапках животных с помощью Egfr, но только при тех же условиях, которые требуются для активации Egfr в ​​ Drosophila .Таким образом, экспрессия XBra не индуцируется в шапочках животных, которые экспрессируют только Egfr, Egfr вместе с mSpi или Egfr вместе с просто ромбовидной и звездной. Напротив, высокий уровень экспрессии XBra индуцируется, когда шапки животных экспрессируют Egfr вместе с mSpi, ромбовидной и Звезда. Требование ромбовидности и звезды для Egfr активация может быть преодолена в анализе с использованием шапочки для животных, как в Drosophila , экспрессируя sSpi, сконструированную форму Spi, которая содержит только внеклеточный домен.Кроме того, Активация Egfr может быть заблокирована, как в случае Drosophila , путем введения Ингибитор Egfr, Argos (Bang, 2000).

Сами по себе, Ромбовид и Звезда каждый слабо способствуют активации mSpi Egfr, однако вместе они сильно синергетический. Таким образом, и ромбовидная, и звездчатая могут быть требуется для достижения максимального уровня активации Egfr, но для более низких уровни передачи сигналов, одного может быть достаточно.Возможно что ромбовидный и звездчатый являются обязательными кофакторами, но есть гомологичные белки, присутствующие в шапке животного, которые выполняют роль недостающего компонента, хоть и слабо. В качестве альтернативы этот результат может отражают способ, которым могут быть достигнуто. В некоторых настройках, таких как жилки крыльев Drosophila , ромбовидный и Звезда созависимы, тогда как в глаз, Звезда достаточно и ромбовидная функция появляется быть необязательным (Bang, 2000).

Затем было определено, требуются ли ромбовидные и звездчатые формы для Egfr. активность, действуя в сигнальной клетке, принимающей клетке или в обе клетки. Для этого замерялась активация XBra в бутерброды, которые были изготовлены из шапочки животного, выражающей Egfr с другой крышкой животного, экспрессирующей mSpi, в присутствии или в отсутствие Ромбовидный и звездный. Когда ромбовид и звезда присутствуют в рецептор-экспрессирующие клетки, mSpi не может активировать Egfr.Однако, когда ромбовидные и звездные присутствуют в В клетках, экспрессирующих лиганд, mSpi сильно активирует Egfr. Было высказано предположение, что ромбовидные и звездчатые могут действовать как клеточная адгезия. молекулы для объединения рецептора и лиганда на поверхности клетки сложный. К проверить эту идею, были сделаны бутерброды, в которых ромбовидных и Star экспрессировались как в отправляющих, так и в принимающих клетках. Интересно, что такая конфигурация снижает уровень Egfr. сигнализация, с наиболее сильным подавлением, когда оба ромбовидных и звезда присутствуют на обеих сторонах сэндвича.Это интригующая возможность, что взаимодействие между Ромбовидность и / или звезда в транс могут ослабить уровень сигнала, полученного Egfr, обеспечивая еще один возможный механизм с помощью которого можно точно настроить уровень активации Egfr. Вместе, эти результаты противоречат моделям, в которых ромбовидная и звездчатая регуляция рецепторная функция или действует как молекула клеточной адгезии и поддерживает модель в которых ромбовидная и звездчатая формы усиливают активацию Egfr, действуя в сигнальная клетка (Bang, 2000).

Был задан вопрос, усиливают ли ромбовидные и звездчатые формы передачу сигналов Egfr посредством изменение активности своего лиганда, как предполагает наблюдение что sSpi не требует Rhomboid и Star для активации Egfr, тогда как mSpi делает. Чтобы ответить на этот вопрос, ученые создали серию химер. замена частей человеческого TGF-альфа, гомолога Spi позвоночных, с соответствующими регионами из mSpi. Один человеческий TGF-альфа сильно активирует человеческий EGFR у животных. колпачок пробирный.Поразительно, когда цитоплазматическая (С) и трансмембранные (TM) домены TGF-альфа заменены доменами mSpi (TGF-alpha / SpiTMC) химерная молекула активирует EGFR человека только при наличии ромбовидной и звездчатой ​​формы. Напротив, химерные молекулы, в которых TGF-альфа C или TM домены заменяются отдельно на домены mSpi (TGF-альфа / SpiC и TGF-альфа / SpiTM, соответственно) конститутивно активны. Таким образом, вместе доменов mSpi TM и C достаточно, чтобы придать ромбовидный и звездная зависимость от TGF-альфа.Этот результат предполагает, что C и Домены TM поддерживают Spi в неактивном состоянии, и что их способность сделать так, можно перенести на другой лиганд EGFR. Как и было предсказано этим интерпретация, мембраносвязанная форма Spi, которая активирует Egfr передача сигналов в отсутствие ромбовидных и звездчатых генов может генерироваться с помощью замена доменов mSpi TM и C доменами TGF-alpha (Spi / TGF-alphaTMC). Кроме того, SpiDelta53C, мутант Spi, в котором 53 карбоксиконцевых остатка удалены и остались 17 цитоплазматических остатков, демонстрирует некоторые ромбовидные и Независимая от звезд активность, что является дополнительным свидетельством того, что домен C играет тормозящую роль.Вместе эти результаты решительно утверждают, что домены C и TM в mSpi действуют, чтобы поддерживать неактивное состояние, с активацией лиганда при взаимодействии с Ромбовид и звезда (Банг, 2000).

Один из способов, которым ромбовидные и звездчатые формы могут приводить к лиганду активация происходит за счет стимулирования протеолитического процессинга, таким образом преобразовывая mSpi в форму, аналогичную sSpi. Учитывая возможность того, что для активировать Egfr, был использован более чувствительный анализ, чтобы определить, Ромбовидная форма и звезда способствуют протеолизу Spi.Кондиционированная среда была приготовлен из диссоциированных клеток шапочки животных из эмбрионов, которым инъецировали РНК, кодирующая sSpi или mSpi, или совместно инъецированная с РНК, кодирующими mSpi, Ромбовидный и Звездный. Крышки животных с инъекцией Egfr инкубировали в кондиционированную среду, а затем анализировали на экспрессию XBra . Кондиционированная среда из шапочек животных, экспрессирующая sSpi или mSpi / Rhomboid / Star содержит активность который активирует Egfr, в то время как из шапочек животных, экспрессирующих только mSpi не.Кроме того, активность кондиционированной среды зависит от Egfr, поскольку она неэффективна для животных, которым не вводили инъекцию. шапки. Эти результаты позволяют предположить, что ромбовидная и Star активирует mSpi, способствуя его расщеплению и секреции (Bang, 2000).

Далее было определено, требуется ли протеолитический процессинг для Ромбовидная и звездчатая активация mSpi. Для этого потенциал сайты для процессинга mSpi были удалены путем удаления последовательностей, кодирующих 15 аминокислот (аа) между доменами Spi EGF и TM (Spi-15aa).Эта область была выбрана, поскольку известно, что расщепление TGF-альфа происходят в аналогичном интервале. При тестировании в тесте на животных шапочка Spi-15aa сильно активирует Egfr ромбовидно и звездно-зависимым образом. Напротив, кондиционированная среда, приготовленная из шапочек животных экспрессирующие Spi-15aa, Rhomboid и Star не содержат никакой активности который активирует Egfr, указывая на то, что Spi-15aa не расщепляется. Взятые вместе, эти результаты предполагают, что расщепление mSpi зависит от последовательности, удаленной в мутанте Spi-15aa; однако mSpi не нужно расщеплять для активации передачи сигналов Egfr.Таким образом, ромбовидный и Star может действовать, чтобы представить mSpi в Egfr и впоследствии способствовать или разрешить его расщепление (Bang, 2000).

Результаты, полученные с мутантом с делецией Spi-15aa, позволяют предположить, что mSpi, как и TGF-альфа, обрабатывается для получения растворимой формы. К исследовать природу этой обработки дальше, была проверена возможность того, что процессинг включает расщепление внутри трансмембранного домена mSpi. На такую ​​возможность указывают результаты, полученные с помощью Химеры Spi / TGF-альфа, показывающие, что Spi трансмембранный домен важен для ромбовидной и звездообразной активация.Более того, другой мультимембранный белок, Пресенилин-1, опосредует протеолиз предшественника бета-амилоида. белок и Notch, оба из которых расщепляются внутри их трансмембранных домены. Если обработка действительно приводит к расколу в мембраны, было рассмотрено, что это высвободит внутриклеточный домен шпица в ромбовидной / звездно-зависимой манере. Чтобы обнаружить это расщепление, была создана химерная молекула, в которой mSpi C домен заменен на myc-tagged, внутриклеточный домен рецептор Notch Xenopus (Spi / NICD).Эндогенный, зависимый от гамма-секретазы сайт расщепления Notch отсутствует в Химерная молекула Spi / NICD. Если протеолитический процессинг этой молекулы происходит внутри Spi TM домен ромбовидным / звездообразным образом, NICD может быть высвобождаются, перемещаются в ядро ​​и активируют гены-мишени. В качестве целевого гена Notch Xenopus Enhancer-of-split-related-1 ( Esr-1 ) был проанализирован в шапках животных, которым одновременно вводили нейролизирующий фактор noggin , потому что Esr-1 обычно экспрессируется в нервной ткани и его индукция by NICD более надежен на фоне noggin (Bang, 2000).

При тестировании в тесте на животных шапочка Spi / NICD активирует Egfr, но только при наличии ромбовидной формы и звезды, что указывает на то, что Химерная молекула Spi / NICD все еще демонстрирует ромбовидную и Звездно-зависимая активность Spi. Этот результат также указывает на то, что маркированный myc Xenopus NICD может эффективно заменить домен Spi C, предполагая, что способность домен C для поддержания Spi в неактивном состоянии больше зависит от его структура, чем на ее первичной последовательности.Существенно, Spi / NICD также активирует ген-мишень Notch, Esr-1 , ромбовидным и звездчатым образом. Этот результат предполагает, что Rhomboid и Star способствуют событию протеолитического процессинга в домене Spi-TM, которое высвобождает NICD. Кроме того, поскольку Esr-1 индукция является ромбовидной и звездной зависимостью в отсутствие Egfr, ромбовидная и звездная индукция может функционировать независимо от Egfr (Bang, 2000).

По аналогии с белком-предшественником бета-амилоида и Notch, чей активности регулируются множественными, взаимозависимыми событиями расщепления, была проверена возможность того, что 15 аминокислот между доменами Spi EGF и TM, которые необходимы для производство растворимых Spi также необходимо для расщепления Химерная молекула Spi / NICD в своем TM-домене.Таким образом, последовательность, кодирующая эти 15 аминокислот, была исчерпана Химера Spi / NICD для производства Spi-15aa / NICD. Этот делеционный мутант все еще сильно активирует Egfr ромбовидно и звездно-зависимым образом, но больше не активирует его. индуцирует Esr-1 , указывая на то, что NICD не высвобождается, и, следовательно, расщепления этого мутанта не происходит. Таким образом, эти результаты предоставляют дополнительные независимые доказательства того, что для ромбовидного и звездообразного расщепления mSpi требуется амино кислоты, удаленные в мутанте Spi-15aa, но mSpi не нужно расщеплять до активировать сигнализацию Egfr.Наконец, эти результаты предполагают, что существует Ромбовидное и звездообразное событие расщепления mSpi в его TM домен. Одно из возможных объяснений этих наблюдений состоит в том, что mSpi равно расщепляется как внутри ТМ домена, так и в пределах 15 аминокислот между домены TM и EGF. В качестве альтернативы, одно расщепление mSpi может происходят в его TM-домене, который зависит от 15-аминокислотного интервала (Bang, 2000).

Некоторые модели могут учитывать ромбовидную и звездно-зависимую наблюдаемые эффекты.Одна из моделей состоит в том, что ромбовидная и звездная требуется для направления mSpi в соответствующий отсек для передачи сигналов происходить. Результаты экспериментов по биотинилированию убедительно свидетельствуют о том, что что ромбовидная форма и звезда не требуются для транспортировки mSpi в поверхность клетки, но остается возможность, что ромбовидные и звездные играют роль в локализации mSpi на специфических микродоменах клеточной поверхности. Альтернативный класс модели заключается в том, что mSpi находится на поверхности клетки и готов к передаче сигнала, но что ромбовидная форма и звезда необходимы для ввода mSpi в активную конформация.Одна из версий этой модели — ромбовидная и звездная. активировать mSpi, способствуя его олигомеризации. Однако эта идея трудно согласиться с наблюдением, что sSpi активен и либо не требует олигомеризации, либо олигомеризуется независимо ромбовидных и звездных. Кроме того, растворимый EGF, который похож на sSpi, связывается как мономер с внеклеточным доменом EGFR в Соотношение 1: 1, предполагая, что мембраносвязанные лиганды EGFR также могут связывают рецептор как мономеры.По этим причинам предпочтение отдается альтернативной модели, в которой mSpi присутствует на мембране. в неактивном димерном или олигомерном комплексе. Ромбовидная и Стар бы требоваться либо для предотвращения образования этого комплекса, либо для изменения его такая конформация, что mSpi может быть представлена ​​как активная форма. Этот модели предшествуют наблюдения, предполагающие, что ряд рецепторные тирозинкиназы существуют в виде неактивных димеров, которые активируются когда специфические межсубъединичные конформационные изменения происходят на лиганде привязка.Таким образом, образование неактивного mSpi комплекс будет опосредован его доменами C и TM и ингибироваться взаимодействие этих доменов с ромбовидной и звездной. Эта модель объясняет, почему удаление этих доменов освобождает от необходимости Ромбовидный и звездчатый, и перенос этих доменов на TGF-альфа дает Ромбовидная и звездная зависимость. Такая модель также предсказывает, что sSpi будет ромбовидной и независимой от звезд (Bang, 2000).

Как ромбовидная и звездчатая формы способствуют расщеплению mSpi? Ромбовидный и / или Star может играть пассивную роль, создавая mSpi доступны для протеолиза при предъявлении.Как вариант, ромбовидный и / или Star может активно способствовать протеолизу Spi. либо путем активации или привлечения протеазы, либо путем транспортировки Spi в соответствующий субклеточный отсек. Также возможно, что ромбовидный и / или Star сами могут обладать протеолитической активностью, как было предложено для пресенилина-1. Протеаза, ответственная за расщепление Spi, еще не идентифицирована. Наконец, хотя это исследование убедительно свидетельствует о том, что презентация Spi тормозится его C-домен, вопрос о том, протеолиз на Spi тоже влияет C-домен, не решался.Например, протеолитический высвобождение внеклеточного домена мембраносвязанного нейрегулина зависит от его цитоплазматического домена. Будущее эксперименты будут направлены на определение того, играют ли ромбовидные и звездные пассивная или активная роль в протеолизе mSpi (Bang, 2000).

Мембранные белки Star и Rhomboid-1 были генетически определены как первичные регуляторы активации рецептора EGF у Drosophila, но понимание их молекулярных механизмов остается неуловимым.Предполагается, что и Star, и Rhomboid-1 работают на поверхности клетки, чтобы контролировать активацию лиганда. Это исследование демонстрирует, что они контролируют передачу сигналов рецепторов, регулируя внутриклеточный трафик и протеолиз лиганда Spitz. Звездочка присутствует на всем секреторном пути и необходима для экспорта шпица из эндоплазматического ретикулума в аппарат Гольджи. Ромбовид-1 локализован в Гольджи, где он способствует расщеплению шпицев. Это определяет новый механизм высвобождения фактора роста, который отличается от зависимого от металлопротеиназ выделения с поверхности клетки (Lee, 2001).

В случае отсутствия Стар шпиц остается в ER. Это объясняет, почему домен активации рецептора EGF намного уже, чем образец экспрессии шпица, и почему эктопическая экспрессия полноразмерного шпица не активирует рецептор. Звезда, белок с одним TMD, сопровождает Spitz в аппарат Гольджи и последующий секреторный путь. Основное взаимодействие между Spitz и Star происходит между люменальными доменами двух белков. Можно предусмотреть две модели: Star может специально блокировать сигнал удержания ER; в качестве альтернативы Стар может активно экспортировать шпица из отделения неотложной помощи и тем самым противодействовать удержанию (Lee, 2001).

Генетика дрозофилы показывает, что Star и Rhomboid-1 являются основными регуляторами активности рецептора EGF: они оба кажутся необходимыми и не могут заменять друг друга. Невозможно разделить их функции. Описанные здесь результаты объясняют их взаимозависимость и синергию, а также обеспечивают четкое механистическое различие между ними. Важный вопрос заключается в том, необходим ли Star для самого ромбоид-1-зависимого протеолиза в качестве ферментативного кофактора.Эту возможность можно исключить, основываясь на химере Spi: TGFalpha-C: он покидает ER независимо от Star и эффективно расщепляется ромбоидом-1 в отсутствие Star, подразумевая, что основная функция Star состоит в том, чтобы экспортировать шпица из ER, тем самым давая ему доступ к Rhomboid-1. Отметим, однако, что Rhomboid-1-зависимое расщепление химеры Spi: TGFalpha-TMC предполагает возможную вторичную, несущественную роль Star как адаптера, доставляющего субстрат к Rhomboid-1. Данные также не исключают роли Стар в обеспечении эффективной секреции шпицев (Lee, 2001).

Данные ясно показывают, что ромбоид-1 является локализованным по Гольджи белком, который запускает протеолитическое расщепление шпица. Следовательно, ромбоид-1 может быть новой протеазой или может рекрутировать неидентифицированную протеазу; для решения этой проблемы потребуются подробные биохимические анализы. Star и Rhomboid-1 достаточны для расщепления шпица во всех протестированных клетках, что позволяет предположить, что они могут быть единственными необходимыми компонентами. Анализ также исключает участие металлопротеаз, которые ответственны за высвобождение TGFalpha и многих других факторов роста, что дополнительно подтверждает идею о том, что ромбоид-1 сам по себе может быть протеазой.Отсутствие генетически идентифицированной протеазы-кандидата, отличной от Rhomboid-1, несмотря на большой генетический скрининг, также согласуется с этой гипотезой. Основное возражение против этой скупой модели — отсутствие у Rhomboid-1 идентифицируемых протеазных доменов. Однако есть два недавних прецедента, когда белки с множественными трансмембранными доменами без узнаваемых протеазных доменов, которые были обнаружены как новые протеазы: пресенилин-1 и протеаза сайта 2 SREBP (Lee, 2001).

Несмотря на различия между процессингом Spitz и TGFalpha, сходство между мухами и млекопитающими может быть больше, чем кажется на первый взгляд.Например, зрелая ТАСЕ (металлопротеаза семейства ADAM, которая действует на TGFalpha) преимущественно локализуется во внутриклеточных компартментах, что позволяет предположить, что клеточная поверхность может быть не единственным местом расщепления TGFalpha. Кроме того, есть данные о TACE-независимом процессинге TGFalpha. Более того, TGFalpha также подвергается регулируемому транспорту посредством секреторного пути, хотя и с помощью особого механизма, зависящего от белков домена PDZ. Наконец, стоит отметить что хотя TGFalpha, по-видимому, является лигандом млекопитающих, наиболее похожим на Spitz, существует несколько других аналогичных лигандов рецептора EGF человека, регуляция которых все еще плохо изучена (Lee, 2001).

Политопный мембранный белок Rhomboid-1 способствует расщеплению заякоренного в мембране TGFalpha-подобного фактора роста Spitz, позволяя ему активировать рецептор EGF дрозофилы. До сих пор механизм этого ключевого сигнального регулятора был неясным, но этот анализ предполагает, что Rhomboid-1 представляет собой новую внутримембранную сериновую протеазу, которая непосредственно расщепляет Spitz. В соответствии с предполагаемым активным сайтом ромбовидной формы, находящимся в мембранном бислое, Spitz расщепляется внутри своего трансмембранного домена и, таким образом, является первым примером фактора роста, активируемого регулируемым внутримембранным протеолизом.Ромбовид-1 сохраняется на протяжении всей эволюции от архей до человека, и эти результаты показывают, что ромбовидный человек способствует расщеплению шпицев по аналогичному механизму. Следовательно, этот механизм активации фактора роста может быть широко распространенным (Urban, 2001).

Хотя ромбоид-1 не содержит каких-либо очевидных доменов гомологии последовательностей, он обладает характеристиками сериновой протеазы. (1) Четыре из шести его основных остатков параллельны остаткам, необходимым для системы реле заряда каталитической триады сериновой протеазы (S217, h381 и N169) и сайту стабилизации оксианиона (состоящему из глицина, находящегося на два остатка от активного серина, и сам серин; G215 и S217).Это две детерминанты активного центра сериновых протеаз, и эти четыре незаменимых остатка составляют все аминокислоты, которые, как известно, непосредственно участвуют в каталитическом механизме сериновой протеазы. (2) Эти остатки абсолютно консервативны для всех ромбовидных тел, и их мутация даже с очень похожими остатками (например, G215A, S217T и S217C) отменяет активность ромбоида-1. Это признаки остатков активного сайта. (3) расположение основных остатков весьма наводит на мысль об активном сайте сериновой протеазы; как G215, так и S217 присутствуют в консервативном мотиве GASGG, который удивительно похож на консервативный мотив GDSGG, окружающий активный серин 200 различных сериновых протеаз.Более того, существенные остатки N169 и h381 находятся на той же высоте в своих трансмембранных доменах (TMD), что и мотив GASGG, что согласуется с предположением, что они ассоциируются с S217, чтобы генерировать каталитическую триаду. Наконец, процессинг Spitz напрямую ингибируется специфическими ингибиторами сериновой протеазы DCI и TPCK, и сам ромбоид-1 становится ограничивающим в их присутствии, что позволяет предположить, что Rhomboid-1 является их прямой мишенью и, следовательно, сериновой протеазой, ответственной за расщепление Spitz (Urban, 2001). ).

Предложенная каталитическая триада ромбоида-1 необычна, поскольку она содержит аспарагин, а не более распространенный аспартат. Центральное значение этого аспартата, однако, неясно, поскольку были идентифицированы сериновые протеазы с каталитическими диадами только серина и гистидина, и даже в ферментах с каталитическими триадами аспартат в 100 раз менее чувствителен к мутации, чем серин или гистидин. гистидин. В случае Rhomboid-1, хотя N169 важен в анализе, представленном в этом исследовании, есть свидетельства того, что в других контекстах его мутация оставляет остаточную активность Rhomboid-1.Дальнейшее подтверждение возможности того, что N169 заменяет аспартат в каталитической триаде, исходит из механизма некоторых цистеиновых протеаз, чьи каталитические механизмы идентичны сериновым протеазам: они используют каталитические триады с аспарагином для ориентации гистидина. В целом, поддерживается идея, что N169 действительно является частью каталитической триады, но без структурного анализа активного центра остается возможность, что он вместо этого может участвовать в стабилизации оксианиона. Итак, хотя остается несколько механистических вопросов, эти результаты убедительно подтверждают, что Rhomboid-1 является сериновой протеазой, которая катализирует протеолиз в мембранном бислое.Поскольку внутримембранная сериновая протеаза не указана ни в базе данных протеаз MEROPS, ни в базах данных ферментов ЕС, Rhomboid-1 и RHBDL2, по-видимому, являются первыми примерами ферментов этого типа (Urban, 2001).

Неясно, как Rhomboid-1 функционирует в липидном бислое. Протеазы катализируют гидролиз пептидной связи и, следовательно, требуют, чтобы вода была доступна их активным центрам. Хотя активный сайт Rhomboid-1 расположен внутри мембранного бислоя, спиральная упаковка между TMD Rhomboid-1 может обеспечивать водную среду, окружающую его активный сайт.В соответствии с этой идеей, существует консервативный спиральный повтор заряженных и / или полярных остатков в TMD II, который вносит вклад в предполагаемый остаток каталитической триады N169; это может сформировать водную среду вокруг активного центра. Это полярное лицо также может опосредовать ассоциации с другими ВНЧС. TMD VI, который вносит предполагаемый остаток каталитической триады h381, также предположительно вносит вклад во взаимодействия TMD: он содержит два тандемных мотива GxxxG, которые, как известно, опосредуют сильные ассоциации между трансмембранными спиралями одинаковой ориентации.Единственными спиралями в Rhomboid-1 той же ориентации, что и TMD VI, являются TMD II и IV, которые вносят вклад в остатки активного сайта N169 и S217, соответственно. Т.о., TMD II, IV и VI могут ассоциироваться, чтобы генерировать предполагаемую каталитическую триаду, в то время как полярная сторона TMD II может обеспечивать локальную водную среду, необходимую для катализа (Urban, 2001).

Протеазы в целом не могут расщеплять свернутые белки, и большинство TMD принимают спиральную конформацию с боковыми цепями аминокислот, обращенными наружу, стерически затрудняя доступ к пептидному остову.Предполагаемая водная полость активного сайта ромбоида-1 может вынудить гидрофобную TMD Spitz изменить конформацию, что приведет к расщеплению. В качестве альтернативы было высказано предположение, что внутримембранные протеазы функционируют, частично разворачивая свои спиральные субстраты, продлевая их в цитозоль и, таким образом, одновременно раскручивая спираль и обеспечивая водную среду для протеолиза. Существенные остатки W151 и R152 в большой люменальной петле Rhomboid-1 могут участвовать в раскручивании субстрата со стороны просвета.Обратите внимание, что модели спиральной упаковки и раскручивания субстрата не обязательно являются взаимоисключающими, и различные аспекты каждой модели могут оказаться важными для внутримембранного протеолиза с помощью Rhomboid-1. В конечном счете, для ответа на многие из этих вопросов потребуется прямой биохимический анализ активности очищенного белка Rhomboid-1, но это еще не было достигнуто для какой-либо внутримембранной протеазы, несмотря на интенсивные исследования. Однако наблюдения, что Rhomboid-1 не требует эндопротеолитической активации или др. Кофакторов Drosophila, предполагает, что эти важные цели могут быть достижимы (Urban, 2001).

Хотя многие другие мембраносвязанные факторы роста активируются протеолитическим высвобождением, шпиц необычен, потому что он расщепляется внутри своего TMD. Регулируемый внутримембранный протеолиз (RIP) недавно появился как новый механизм для управления несколькими важными сигнальными путями, включая активацию рецептора Notch и биосинтез холестерина, путем высвобождения доменов цитоплазматического фактора транскрипции из закрепленных на мембране белков. Как и другие известные протеазы RIP, ромбоид-1 представляет собой политопный мембранный белок, который является членом большого семейства белков с гомологами у многих видов.Однако ранее описанные протеазы RIP были ограничены либо аспартил-, либо металлопротеазами, в то время как ромбовидная протеаза представляет собой сериновую протеазу. Помимо этого механистического различия, есть два основных различия между путями, участвующими в современных примерах расщепления RIP и Spitz с помощью Rhomboid-1 (Urban, 2001).

(1) Ранее охарактеризованные примеры RIP приводят к цитоплазматическому высвобождению либо связанных с мембраной факторов транскрипции, либо белков, которые необходимы для активации факторов транскрипции.Напротив, расщепление шпица высвобождает фактор роста в просвет аппарата Гольджи, который затем секретируется как активный сигнал для рецептора EGF в соседних клетках. (2) Существует также четкое различие между механизмами, регулирующими внутримембранное расщепление. Все другие известные протеазы RIP широко экспрессируются и обладают широкой субстратной специфичностью. Внутримембранное расщепление регулируется предварительным расщеплением, которое удаляет большую часть просветных или внеклеточных частей целевого белка.Только после этого расщепления внутримембранные протеазы могут распознавать и расщеплять свои субстраты. Напротив, активность ромбоида-1 регулируется в первую очередь его транскрипцией; Экспрессия Rhomboid-1 строго регулируется и точно определяет передачу сигналов рецептора EGF во время развития дрозофилы. Более того, Rhomboid-1 является сайт-специфичным по своей способности к расщеплению, поскольку он специфически расщепляет Spitz, но не подобные белки, такие как TGFalpha. Человеческие ромбовидные тела также обнаруживают специфичность, поскольку RHBDL2, но не RHBDL, расщепляет шпица (Urban, 2001).

Поскольку Drosophila Rhomboid-1 является прототипом семейства, состоящего из более чем 75 белков, как у прокариот, так и у эукариот, понимание способа его действия имеет значение, выходящее за рамки передачи сигналов и развития Drosophila. Кроме того, сохранение протеолитической функции и биохимического механизма в человеческом ромбовидном теле в сочетании с абсолютным сохранением предполагаемых каталитических остатков предполагает, что все ромбовидные тела являются внутримембранными сериновыми протеазами. Хотя их физиологические роли остаются неясными, примечательно, что большинство, но не все организмы имеют ромбовидные формы.Это согласуется с ролью в важных, но не существенных процессах, например, в межклеточной передаче сигналов. Интересно, что недавний анализ подтверждает это мнение. Был изучен только один член ромбовидной формы вне дрозофилы. В патогенной бактерии человека Providencia stuartii ромбоподобный белок AarA участвует в стимулировании высвобождения неизвестного фактора, который регулирует вирулентность в ответ на размер популяции клеток (Rather, 1999; Gallio, 2000). Грамположительные бактерии, такие как Providencia, используют факторы на основе пептидов в качестве сигналов чувствительности кворума, и в некоторых случаях они протеолитически высвобождаются из предшественников.Таким образом, хотя текущие данные очень ограничены, примечательно, что даже у бактерии ромбовидно-зависимый протеолиз может быть вовлечен в производство сигналов во время клеточной коммуникации. Протеазы контролируют многие аспекты клеточной регуляции; они также имеют существенное клиническое значение. Таким образом, определение субстратов других ромбовидных тел должно выявить их физиологические и, возможно, патологические роли у людей и других видов (Urban, 2001).

Drosophila имеет три мембранно-связанных эпидермального фактора роста (EGF)-подобных белков: Spitz, Gurken и Keren.Генетически подтверждено, что шпиц и гуркен активируют рецептор EGF, но Керен не охарактеризован. Шпиц активируется регулируемой внутриклеточной транслокацией и расщеплением трансмембранными белками Star и протеазой Rhomboid-1 соответственно. Ромбоид-1 является членом семейства из семи подобных белков у Drosophila. Были исследованы четыре члена семейства ромбовидных: все являются протеазами, которые могут расщеплять Spitz, Gurken и Keren, и все они активируют только передачу сигналов рецептора EGF in vivo.Звезда действует как фактор экспорта эндоплазматического ретикулума (ER) для всех трех. Важность этой транслокации подчеркивается тем фактом, что, когда шпиц расщепляется ромбами в ER, он не может секретироваться. Керен активирует рецептор EGF in vivo, что дает убедительные доказательства того, что это настоящий лиганд. Эти данные демонстрируют, что все связанные с мембраной лиганды EGF у Drosophila активируются с помощью одной и той же стратегии расщепления с помощью Rhomboids, которые являются древними и широко распространенными внутримембранными протеазами. Это отличается от индуцированной металлопротеазой активации EGF-подобных лигандов млекопитающих (Urban, 2002).

Стар регулирует расщепление шпица с помощью ромбоида-1, транспортируя шпица к аппарату Гольджи. Поразительно, хотя Star был важен для секреции лиганда в культуральную среду в каждом случае, он не влияет на способность ромбов 2, 3 и 4 катализировать расщепление шпица. Обширное O -связанное гликозилирование, которое является диагностическим признаком прохождения через аппарат Гольджи (и которое увеличивает кажущуюся молекулярную массу Spitz), не присутствовало в клеточных лизатах.Следовательно, в отличие от Rhomboid-1, Rhomboids 2, 3 и 4 вызывают накопление внутриклеточного расщепленного шпица, который не транспортируется мимо сети trans -Golgi и, таким образом, не секретируется (Urban, 2002).

Способность ромбов 1-4 катализировать расщепление шпица в тесте на культуре ткани предполагает, что все они могут участвовать в активации рецептора EGF in vivo . Это было ясно продемонстрировано для ромбовидной-1, было генетически детерминировано в случае ромбовидной-3 и было предложено для ромбовидной-2.Для дальнейшего исследования потенциальную активность ромбов 2-4 in vivo сравнивали путем их сверхэкспрессии в развивающихся тканях дрозофилы. Во всех исследованных случаях ромбовидные 2-4 вызывают фенотип, сходный с ромбовидным-1, что согласуется только с гиперактивацией рецептора EGF. При экспрессии в развивающемся крыле, напр., Все стержневые ромбоиды продуцируют эктопические и утолщенные фенотипы вен, подобные тем, которые наблюдаются для ромбовидных-1. Этот фенотип был предсказуемо изменен мутациями в других участниках пути рецептора EGF.Кроме того, как и в анализах на культуре клеток, все четыре ромбовидных тела синергичны с коэкспрессией Star. Во всех случаях UAS Rhomboids 1 и 3 продуцируют стабильно сильные фенотипы крыльев, тогда как Rhomboids 2 и 4 более слабые. Аналогичные результаты были получены для глаза, фолликулов яичника и эмбриона. Важно отметить, что никаких других фенотипов не наблюдалось в глазах, крыльях или эмбрионах, экспрессирующих ромбовидные формы, что позволяет предположить, что они не влияют на какие-либо другие пути. Если, например, ранее не охарактеризованные ромбовидные 2 или 4 вызывали активацию др. Сигнальных путей, их эктопическая экспрессия д. Приводить к дополнительным фенотипам.Эти наблюдения подтверждают, что ромбоиды 2-4 обладают такой же протеолитической активностью, как ромбоид-1; кроме того, отсутствие фенотипов, связанных с другими путями, убедительно свидетельствует о том, что все ромбовидные тела 1-4 предназначены для регуляции передачи сигналов рецептора EGF. Эти данные демонстрируют, что все ромбоиды 1-4 обладают протеолитической активностью против лиганда Spitz (Urban, 2002).

Новый шпицеподобный ген был идентифицирован как кДНК, представленная в GenBank проектом по секвенированию кДНК дрозофилы Беркли.С последующим завершением последовательности генома дрозофилы этот ген был аннотирован как Керен и является единственной ранее неизвестной связанной с мембраной EGF-подобной молекулой, идентифицированной проектом генома дрозофилы. Ранее Керен называли Шпиц-2 и Гриц. Подобно Spitz и Gurken, Keren имеет единственный внеклеточный повтор EGF и единственный трансмембранный домен. Аминокислотная последовательность Керен более близка к Шпицу, чем к Гуркену (идентичность 49%, сходство со шпицами 55%; идентичность 30%, сходство с Гуркеном 37%).В то время как все три лиганда, как было предсказано, имеют N, — и O -связанные сигналы гликозилирования, Spitz содержит вставку из 10 остатков на своем N-конце, которая содержит дополнительный сайт гликозилирования, связанный с O . В соответствии с этим, Spitz является единственным лигандом, который гипергликозилируется в присутствии Star, хотя удаление вставки не полностью устраняет гипергликозилирование. Ромбовидные 1-4 все расщепляли Керен в анализе культуры ткани млекопитающих. Однако было интересное различие между Кереном и Шпицем: звезда не во всех случаях необходима для секреции Керен.Значительное количество керен секретировалось только в присутствии ромбов 3 и 4. Несмотря на это, Стар всегда усиливал секрецию расщепленного Керен, подразумевая, что он может взаимодействовать с Кереном (Urban, 2002).

Роль звезды в активации шпица состоит в том, чтобы экспортировать шпица из ER в аппарат Гольджи, где он сталкивается с протеолитической активностью ромбоида-1. Стар также способствует высвобождению Керен в среду, предполагая, что его роль аналогична роли в обработке шпица. Это перемещение Keren очень похоже на перемещение, наблюдаемое для Spitz, предполагая, что Keren также нуждается в перемещении в аппарат Гольджи для эффективной обработки и секреции (Urban, 2002).

Поразительное разнообразие гликозилирования происходит в комплексе Гольджи специфичным для белков образом, но как достигается это разнообразие и специфичность, остается неясным. Это исследование показывает, что уложенные друг на друга фрагменты (единицы) комплекса Гольджи, диспергированные в клетках имагинального диска Drosophila, функционально разнообразны. UDP-транспортер сахара Fringe-Connection (Frc) локализован в подмножестве единиц Гольджи, отличных от тех, которые содержат бессульфатные (Sfl), которые модифицируют глюкозаминогликаны (GAG), и от тех, которые содержат протеазу Rhomboid (Rho), которая обрабатывает гликопротеиновый шпиц (Spi).В то время как гликозилирование и функция Notch затрагиваются в имагинальных дисках мутантов frc , гликозилирование и функция ядерных белков GAG — нет, даже несмотря на то, что Frc транспортирует широкий спектр субстратов гликозилирования, что позволяет предположить, что единицы Гольджи, содержащие Frc и содержащие Sfl или Rho функционально разделимы. Отдельные единицы Гольджи, содержащие Frc и Rho в эмбрионах, также могут быть разделены биохимически с помощью методов иммуноизоляции. Показано, что гликан Tn-антиген локализован только в подмножестве единиц Гольджи, базально распределенных в поляризованной клетке.Предполагается, что разные локализации среди разных единиц Гольджи молекул, участвующих в гликозилировании, лежат в основе разнообразия модификаций гликанов (Yano, 2005).

Паттерн гликозилирования чрезвычайно разнообразен, но при этом очень специфичен для каждого белка. Как достичь этой специфичности (и разнообразия)? Существует> 300 гликозилензимов у человека и> 100 у дрозофилы, но достаточна ли их ферментативная специфичность, чтобы объяснить точную модификацию всех субстратов? Одним из возможных механизмов, который может также вносить вклад в специфический (и разнообразный) паттерн гликозилирования, может быть локализация / компартментализация гликозилензимов (Yano, 2005).

Комплекс Гольджи, в котором происходит гликозилирование белков, рассматривался как единая функциональная единица, состоящая из цис-, медиальных и транскистерн в клетках млекопитающих. Однако трехмерная реконструкция электронно-микроскопических изображений структуры Гольджи млекопитающих предположила существование более чем одной стопки Гольджи, при этом отдельные стопки соединены в ленту канальцами, соединяющими эквивалентные цистерны. Более того, во время митоза цистерны Гольджи клеток млекопитающих становятся фрагментированными без их разборки.У Drosophila цистерны Гольджи сложены друг над другом, но не соединены, чтобы сформировать ленту на стадиях эмбриона и куколки даже во время интерфазы, хотя на сегодняшний день нет доказательств, указывающих на функциональные различия между фрагментами Гольджи (Yano, 2005).

UDP-транспортер сахара дрозофилы, соединение Fringe (Frc) транспортирует широкий спектр UDP-сахаров, которые могут использоваться для синтеза различных гликанов, включая N-связанные типы, GAG и типы муцина. Интересно, что несмотря на его широкую специфичность, исследования потери функции показали, что Frc избирательно необходим для гликозилирования Notch, но не для синтеза GAG.Это наблюдение побудило исследовать локализацию Frc; в этом исследовании было обнаружено, что Frc локализуется только в субнаборе фрагментов Гольджи в дисках и эмбрионах Drosophila (Yano, 2005).

Frc, Sfl, гликозилензим ГАГ, и Rho, фермент процессинга гликопротеина Spi, локализованы в отдельных фрагментах Гольджи, которые называются «единицами Гольджи» в клетках дрозофилы. frc Мутанты не обнаруживают дефектов гликозилирования и функции Spi, а также не проявляют дефектов гликозилирования или функции ядерных белков GAG.Более того, биохимически разделенные отдельные единицы Гольджи, содержащие Frc и Rho, были выделены методом иммуноизоляции. Это исследование ясно показывает, что существуют функционально различные единицы Гольджи в клетке дрозофилы (Yano, 2005).

Комплекс Гольджи представляет собой стопку цис-, медиально- и трансцистерн в клетках млекопитающих. Напротив, маркеры Гольджи часто не перекрываются друг с другом в Saccharomyces cerevisiae , в котором цистерны Гольджи не сложены, а разобраны.Цистерны Гольджи у дрозофилы сложены друг на друга, но не соединены между собой, образуя ленту на стадиях эмбриона и куколки даже во время интерфазы. Чтобы определить, собрали ли клетки имагинального диска Drosophila или разобрали цистерны Гольджи, сравнивали локализации цис-цистернального маркера dGM130, транцистернального маркера dSyntaxin16 (dSyx16) и связанного с Гольджи белка массой 120 кДа, который обычно используется для обнаружения комплекс Гольджи у дрозофилы. Белок массой 120 кДа был идентифицирован с помощью иммуноаффинной очистки и секвенирования белка как гомолог дрозофилы медиального сиалогликопротеина Гольджи 160 кДа позвоночных (MG160), который равномерно находится в медиально-цистернах аппарата Гольджи в клетках позвоночных.Антитело, специфичное к белку массой 120 кДа, также окрашивало многочисленные фрагменты Гольджи в клетках имагинального диска. Более 80% иммунореактивности для белка массой 120 кДа колокализуется как с dGM130, так и с dSYX16, что позволяет предположить, что белковые позитивные фрагменты комплекса Гольджи массой 120 кДа действительно включают собранные цистерны; эти фрагменты мы будем называть «единицами Гольджи». Распределение белка массой 120 кДа, dGM130 и агглютинина арахиса (PNA), другого транцистернального маркера, также показывает, что маркеры близко расположены, но не идентичны, что позволяет предположить, что единицы Гольджи поляризованы.Интересно, что большинство PNA-позитивных транскистернов ориентировано на базальную сторону клетки, внутри комплекса Гольджи, тогда как большинство GM130-позитивных цис-цистерн ориентированы на апикальную сторону клетки. Цис-к-транс полярность каждой единицы Гольджи, таким образом, по-видимому, коррелирует с апико-базальной полярностью дисковых клеток (Yano, 2005).

Личинки мутантов дрозофилы, дефектные по UDP-транспортеру сахара Frc, проявляют высокоселективный фенотип: отсутствие гликозилирования Notch в присутствии нормального синтеза GAG (Goto, 2001).Этот ограниченный фенотип был неожиданным, учитывая, что Frc проявляет широкую специфичность в отношении UDP-сахаров, используемых в синтезе различных гликанов, включая N-связанные типы, GAG и типы муцина. Однако, учитывая, что аллель frc ^R29 , изученный ранее (Goto, 2001), является гипоморфным, было исследовано, может ли дефект селективного гликозилирования быть следствием частичной потери активности Frc. С использованием неточного вырезания был сгенерирован новый аллель frc ^RY34 , присутствие которого приводит к гибели большинства личинок на стадии второго возраста, намного раньше, чем гибель, вызванная frc ^R29 .ПЦР-анализ в реальном времени показал, что количество транскриптов frc в личинках второго возраста у мутантов frc ^RY34 или frc ^R29 составляло 4,2% и 24,4% от количества транскриптов дикого типа, соответственно. Примерно 1 т.п.н. гена, включая сайт инициации транскрипции, был удален в аллеле frc ^RY34 . В совокупности эти наблюдения предполагают, что frc ^RY34 по существу является нулевым аллелем (Yano, 2005).

Клональные клетки мутанта frc ^RY34 демонстрируют нормальные уровни ГАГ, как обнаружено с помощью иммуноокрашивания антителом 3G10, тогда как количество ГАГ было снижено в клонах мутантных клеток tout-velu ( ttv ). . Учитывая, что GAG необходимы для передачи сигналов Hedgehog (Hh), Wingless (Wg) и Decapentaplegic (Dpp), была исследована экспрессия соответствующих генов-мишеней [ пропатчен ( ptc ) для передачи сигналов Hh и Dll для Wg. и передача сигналов Dpp] в дисках крыльев мутанта frc ^RY34 .Экспрессия ptc и Dll в вентральном компартменте крыльевых дисков не затрагивалась в мутантных клонах, что указывает на нормальную функцию GAG (Yano, 2005).

Учитывая, что гликозилирование Notch с помощью Fringe (Fng), фукозоспецифической ß1,3- N -ацетилглюкозаминилтрансферазы, требует активности Frc, гликозилирование Notch было исследовано на мутанте frc ^RY34 . Мутантные клоны frc ^RY34 в дорсальном компартменте, но не в вентральном компартменте, крыльевых дисков индуцируют экспрессию wg на своих границах, как это наблюдалось с мутантными клонами fng , предполагая, что гликозилирование Notch нарушена в мутанте frc ^RY34 .Эктопическая экспрессия Wg, индуцированная мутантными клонами frc ^RY34 , вероятно, ответственна за наблюдаемую индукцию экспрессии Dll в дорсальном компартменте (Yano, 2005).

Чтобы определить, почему потеря UDP-транспортера сахара с широкой специфичностью избирательно влияет на гликозилирование Notch, исследовали субклеточную локализацию Frc. Frc, меченный эпитопом Myc, экспрессировался в имагинальных дисках под контролем драйвера arm-Gal4.Индуцированная Gal4 экспрессия Frc-Myc восстанавливает мутантный фенотип frc , предполагая, что Frc-Myc является функциональным и правильно локализованным. Иммуноокрашивание имагинальных дисков личинок дикого типа, экспрессирующих Frc-Myc, с помощью антител к Myc и белку массой 120 кДа выявило, что Frc локализуется только в небольшом подмножестве единиц Гольджи. Т.о., предполагается, что единицы Гольджи могут быть функционально гетерогенными и что те, которые содержат Frc, могут модифицировать некоторые белки, включая Notch, но не другие (Yano, 2005).

Чтобы проверить эту гипотезу, локализации различных молекул, участвующих в модификации белка в комплексе Гольджи, сравнивали с локализацией Frc. Было обнаружено, что Sfl также ограничен подмножеством единиц Гольджи, но его распределение не перекрывается с распределением Frc. Эта дифференциальная локализация Sfl и Frc может, таким образом, объяснить наблюдение, что frc мутантные клоны в дисках крыльев не обнаруживают каких-либо дефектов в синтезе GAG с помощью Sfl (Yano, 2005).

Spi-процессирующий фермент Rho также был локализован в субнаборе единиц Гольджи, отличных от тех, которые содержат Frc, в дополнение к его присутствию в других компартментах.Этот результат указывает на существование по крайней мере двух типов единиц Гольджи, содержащих Rho и содержащих Frc. Чтобы определить, различаются ли эти два типа единиц Гольджи функционально, состояние гликозилирования и функция Spi были исследованы у мутантов frc (Yano, 2005).

Учитывая, что степень гликозилирования Notch, определяемая агглютинином зародышей пшеницы (WGA), заметно снижена у мутантов frc по сравнению с таковой в фоне дикого типа (Goto, 2001), то может ли WGA-реактивный гликан На Spi также влияет мутация frc. Была исследована мутация .Меченный эпитопом Myc Spi экспрессировался в мутанте frc ^RY34 дикого типа. Затем Spi-Myc осаждали из гомогенатов личинок с помощью антител к Myc и исследовали на его гликозилирование с помощью SDS / PAGE и последующего блот-анализа с помощью WGA. Реакционная способность Spi-гликана с WGA была сходной у мутанта frc и у мутанта дикого типа. Влияет ли мутация frc ^RY34 на Spi-гликан, исследовали с помощью анализа сдвига подвижности.Электрофоретическая подвижность гликозилированного Spi дикого типа также была подобна таковой у мутанта frc . Дегликозилирование Spi нейраминидазой, пептидом- N -гликозидазой (PNGase) F и O -гликаназами также увеличивало его подвижность в той же степени у личинок дикого типа и у мутантных личинок frc , что позволяет предположить, что коровый белок не является затронуты мутацией frc . Вместе эти результаты указывают на то, что функция Frc не является необходимой для образования Spi гликана (Yano, 2005).

Функция Spi оценивалась путем изучения процессов развития, таких как рекрутирование фоторецепторов и образование прицветников, оба из которых требуют активации Spi. Во время развития глаза, хотя Spi не является необходимым для первичной индукции фоторецептора R8, он необходим для последующего набора R1 в R7. Учитывая, что фоторецепторы с R1 по R8 экспрессируют ELAV и что R1 и R6 экспрессируют Bar, экспрессию этих белков исследовали на мутантах frc .У мутантов, несущих гипоморфный аллель frc ^R29 , все фоторецепторы обычно индуцируются, хотя их направление нерегулярно, как это видно у мутантов fringe или Notch . Аналогичные результаты были получены при клональном анализе мутантов frc ^RY34 . Таким образом, функция Spi в рекрутировании фоторецепторов не нарушалась у мутантов frc . Мутант frc ^R29 также образовывал нормальные прицветники на деформированных ногах.Были проведены тесты на генетическое взаимодействие между мутациями rho и frc в формировании крыловых жилок. Мутант rho ^ve1 жизнеспособен, но демонстрирует частичную потерю жилок L3-5. Этот фенотип также проявляется у мух rho ^ve1 , frc ^RY34 / rho ^ve1 , frc ⁺ , что позволяет предположить, что Frc не влияет на функцию Rho. Из этих результатов можно сделать вывод, что на функцию пути Rho-Spi не влияет мутация frc (Yano, 2005).

Чтобы подтвердить, что единицы Гольджи, содержащие Frc, и единицы, содержащие Rho, различаются, проверяли возможность селективного выделения этих единиц Гольджи с использованием антител к Myc (для меченого Myc Frc) или HA (для Rho, меченного HA). Поскольку трудно собрать достаточное количество имагинальных дисков, исходный материал был переключен на эмбрионы, и было исследовано, локализованы ли также Frc и Rho в разных единицах Гольджи у эмбрионов. Frc-Myc и Rho-HA коэкспрессируются в эмбрионах драйвером arm-Gal4; Иммуноокрашивание антителами к Myc и HA показало, что единицы Гольджи, содержащие Frc-Myc (45.4% от общего числа единиц Гольджи) и те, которые содержат Rho-HA (43,0% от общего числа единиц Гольджи), в значительной степени отличаются: только 11,6% от общего числа единиц Гольджи были положительными как для Frc-Myc, так и для Rho-HA. Иммуноизоляция была предпринята из эмбриональных лизатов с использованием либо антитела к Myc, либо HA, и было исследовано, сколько Frc-Myc и Rho-HA были совместно изолированы в каждом иммуноизоляте. Когда Frc-Myc был иммуноизолирован с помощью антитела к Myc, восстановление Frc-Myc было в 5,7 раза больше, чем у Rho-HA. Более того, когда Rho-HA был иммуноизолирован с помощью антитела к HA, восстановление Rho-HA составило 18.В 3 раза больше, чем у Frc-Myc. Иммуноблот-анализ этих иммуноизолятов с антителом против 120 кДа подтвердил, что единицы Гольджи были сконцентрированы в этих иммуноизолятах. Эти результаты подтверждают мнение о том, что фракция, содержащая Frc-Myc, отличается и может быть отделена от фракции, содержащей Rho-HA (Yano, 2005).

Было исследовано, содержат ли эти отдельные единицы Гольджи разные составляющие. Fringe (Fng) — одна из молекул-кандидатов, которые могут колокализоваться с Frc.Поэтому экспрессию эктопически экспрессируемого Fng исследовали в иммуноизолатах, содержащих Rho и Frc. Было обнаружено, что экспрессия Fng в Frc-содержащих иммуноизолятах была в 26 раз выше, чем в Rho-содержащих иммуноизолятах, подтверждая идею о том, что Fng локализуется в Frc-положительных единицах Гольджи, а не в Rho-положительных единицах Гольджи. Также с помощью анализа иммуноокрашивания было подтверждено, что Fng колокализуется в основном с Frc (88,1% FNG-положительных единиц Гольджи), но не с Rho (16.6% Fng-положительных единиц Гольджи) методом иммуноокрашивания (Яно, 2005).

Данные предполагают, что разные единицы Гольджи выполняют разные функции, это мнение также подтверждается наблюдением, что антиген Tn (O-связанный N -ацетилгалактозамин) был обнаружен только в подмножестве единиц Гольджи в клетках имагинального диска глаза. Кроме того, было обнаружено, что большинство этих Tn антиген-положительных единиц Гольджи распределены в базальной области дисковых клеток, подтверждая, что дифференциальное распределение единиц Гольджи может вносить вклад в апикобазальную полярность распределения гликанов (Yano, 2005).

В отличие от личиночной стадии, Frc необходим для синтеза GAG на ранней эмбриональной стадии (Goto, 2001; Selva, 2001). Чтобы определить, почему потребность в Frc для синтеза GAG различается между эмбриональной и личиночной стадиями, эмбрионы, экспрессирующие Frc-Myc, окрашивали антителами к Sfl и к Myc. Было обнаружено, что Sfl колокализуется с Frc, что, вероятно, объясняет важность Frc для синтеза GAG на эмбриональной стадии. Кроме того, эта эмбриональная потребность в Frc для синтеза GAG исключает возможность того, что селективные дефекты в Notch, а не в синтезе GAG, наблюдаемые у мутантных личинок frc , вызваны селективным Frc-зависимым транспортом подмножества используемых только UDP-сахаров. для гликозилирования Notch, но не для синтеза ГАГ (Yano, 2005).

Таким образом, эти результаты предоставляют доказательства существования функционально различных единиц Гольджи в клетках дрозофилы. Такая функциональная гетерогенность единиц Гольджи, вероятно, ответственна за разнообразие гликозилирования белков. По крайней мере два типа единиц Гольджи, содержащие либо Frc, либо Sfl, присутствуют в клетках личиночного диска. Два отдельных набора белков, примером которых являются ядерные белки Notch и GAG, могут, таким образом, избирательно транспортироваться к Frc- или Sfl-содержащим единицам Гольджи, соответственно, где они подвергаются гликозилированию с помощью разных наборов молекул (Yano, 2005).

Разнообразие единиц Гольджи может быть установлено путем раздельного транспорта секреторных белков и гликозилензимов от эндоплазматического ретикулума (ER) к отдельным единицам Гольджи. У дрожжей заякоренные гликозилфосфатидилинозитолом (GPI) белки выходят из ER в везикулах, отличных от тех, которые содержат другие секреторные белки. Учитывая, что ядерный белок GAG Dally у Drosophila прикреплен к мембране с помощью GPI, возможно, что Dally и Notch загружаются в отдельные пузырьки, когда они выходят из ER (Yano, 2005).

Комбинации гликозилензимов и транспортеров, таких как Sfl и Frc, содержащиеся в единицах Гольджи дрозофилы, различаются не только между эмбрионами и клетками личиночного диска, но также и между типами клеток. Напр., Frc локализован во всех единицах Гольджи в клетках слюнных желез на личиночной стадии. Также было показано, что все комплексы Гольджи, диспергированные в ооцитах, могут обладать способностью обрабатывать белок-предшественник Гуркена, который обычно расщепляется в подмножестве комплексов Гольджи, находящихся в дорсо-передней области.Таким образом, единицы Гольджи могут изменяться в зависимости от развития, типа клеток и сигнальных процессов (Yano, 2005).

Функциональное разнообразие единиц Гольджи также может вносить вклад в поляризованное распределение гликанов вдоль апикобазальной оси клеток. Было обнаружено, что антиген Tn синтезируется в базальных единицах Гольджи клеток личиночного диска. Кроме того, определенные типы гликанов распределены вдоль апикобазальной оси омматидий куколки. Эти гликаны могут, таким образом, синтезироваться по-разному в единицах Гольджи, которые асимметрично распределены вдоль апикобазальной оси и затем секретируются либо на апикальной, либо на базальной клеточной поверхности (Yano, 2005).

В то время как единицы Гольджи рассредоточены по клеткам дрозофилы, комплекс Гольджи в клетках млекопитающих считается единым целым, который расположен в перицентриолярной области благодаря его ассоциации с центром организации микротрубочек в интерфазе и который фрагментируется в начале митоз. Фрагменты Гольджи, обнаруживаемые в клетках млекопитающих во время митоза, очень похожи на единицы Гольджи клеток дрозофилы как на электронных, так и на конфокальных микроскопических изображениях. Комплекс Гольджи млекопитающих во время интерфазы может, следовательно, состоять из функционально различных единиц, которые связаны с центром организации микротрубочек и связаны друг с другом (Yano, 2005).

Шпиц (Spi) — наиболее известный лиганд рецептора EGF дрозофилы. Он продуцируется как неактивный предшественник мембраны, который сохраняется в эндоплазматическом ретикулуме (ER). Чтобы разрешить расщепление, Стар транспортирует Spi к Гольджи, где он подвергается расщеплению ромбовидной формой. Поскольку некоторые фенотипы Egfr не имитируются ни одним из его известных активирующих лигандов, дополнительный лиганд (Keren) был идентифицирован при поиске в базе данных.Krn является функциональным гомологом Spi, поскольку он может восстанавливать мутантный фенотип spi Rho- и Star-зависимым образом. В отличие от Spi, однако, Krn также обладает Rho / Star-независимой способностью подвергаться низкоуровневому расщеплению и активации Egfr, что очевидно как в культуре клеток, так и у мух. Разница в базовой активности коррелирует с клеточной локализацией двух лигандов. В то время как Spi сохраняется в ER, задержка Krn является лишь частичной. Изучение химерных и делеционных конструкций Spi / Krn указывает на то, что цитоплазматический домен Spi ингибирует его базальную активность.Низкий уровень активности Krn требует жестко регулируемой экспрессии предшественника Krn (Reich, 2002).

Для идентификации дополнительных лигандов Egfr в ​​базах данных был проведен поиск новых гомологов Spi. Было обнаружено, что два тега экспрессируемой последовательности (EST), представляющие один и тот же ген, являются высоко гомологичными Spi (LD34470 и LD34429), что соответствует 74E / F. Полная последовательность обоих EST выявила открытую рамку считывания из 217 аминокислот (Reich, 2002).

В трех активирующих лигандах Egfr, идентифицированных к настоящему времени, гомология была ограничена доменом EGF.Напротив, сходство между Spi и новым предполагаемым лигандом, распространяющимся по всей кодирующей области, составляет 56%. Длина и доменная организация обоих белков подобны. Гомологичные участки сосредоточены в основном во внеклеточном домене, со значительной идентичностью в домене EGF (65%), в то время как ограниченная гомология может быть обнаружена в цитоплазматическом домене. Из-за сходства с Spi этот белок был назван Керен, что на иврите означает рог или острый предмет (Reich, 2002).

EST Krn состоят из двух экзонов, при этом вся кодирующая область расположена во втором экзоне. Интересно, что 5′-некодирующий экзон также обнаруживается в EST кодирующей последовательности, расположенной более 3 ‘от гена, кодирующего Krn. Эта кодирующая последовательность гомологична новым белкам мыши и человека. Сплайсинг 5’-некодирующего экзона с транскриптом TGFa был подтвержден с помощью ОТ-ПЦР РНК, экстрагированных из взрослых мух и клеток S2. Согласно данным ОТ-ПЦР, Krn экспрессируется на стадиях эмбрионального и личиночного развития, а также у взрослых.Были предприняты попытки изучить паттерн экспрессии Krn с использованием гибридизации RNA in situ и окрашивания антителами на эмбрионах дикого типа или имагинальных дисках, но сигнал был ниже уровня обнаружения (Reich, 2002).

Spi активен только как расщепленный фрагмент (sSpi), который диффундирует в соседние клетки и активирует рецептор. Следуя этой парадигме, секретируемая форма Krn (sKrn) была сверхэкспрессирована в различных тканях. Действительно, во всех тканях фенотипы sKrn напоминали эктопический фенотип sSpi.В крыле MS1096-Gal4, управляющий sKrn, приводил к летальному исходу, но у нескольких выживших были короткие вздутые обрубки вместо крыльев. В яичнике экспрессия sKrn в клетках переднего фолликула с использованием 55B-Gal4 приводила к образованию дополнительных дорсальных придатков. Эктопический sKrn, управляемый 69B-Gal4 в эмбриональных эктодермальных клетках, вызывает летальность, при этом кутикула демонстрирует более широкие и прямоугольные зубчатые пояса, характерные для гиперактивации Egfr. Очевидно, что sKrn может активировать MAPK, как показывает антитело dpERK) везде, где он экспрессируется в эмбрионе или в крыловом диске.Эти результаты показывают, что sKrn может имитировать активность sSpi и активировать путь Egfr (Reich, 2002).

Продемонстрировав биологическую активность sKrn, было интересно определить, регулируется ли его процессинг аналогично Spi. Запуск Egfr с помощью Spi на стадии 10 генерирует два важных домена активации, в трахеальных плакодах и вентральной эктодерме. Эти домены соответствуют сайтам экспрессии Rho в трахеальных плакодах и средней линии соответственно.dpERK может быть легко обнаружен в этих доменах, тогда как у spi мутантных эмбрионов на этой стадии не наблюдается dpERK. Была исследована способность предшественника Krn спасать мутантные эмбрионы spi . Когда Krn повсеместно экспрессировался в эктодерме spi ^— эмбрионов (с использованием драйвера 69B-Gal4), наблюдали полное восстановление паттерна dpERK. Индукция пути с помощью Krn в сайтах экспрессии Rho в средней линии и трахеальных плакодах указывает на то, что, как и в Spi, процессинг Krn зависит от Rho.Чтобы проверить, требует ли расщепление Krn Star, Krn был экспрессирован в мутантных эмбрионах Star . По данным dpERK, восстановления фенотипа не наблюдалось. Таким образом, можно сделать вывод, что, как и Spi, процессинг Krn зависит от Rho и Star (Reich, 2002).

Хотя Spi является чрезвычайно мощным лигандом в его секретируемой форме, при экспрессии в форме предшественника, даже на высоких уровнях, он не проявляет эктопической активности. Следуя этой парадигме, спасение мутантных эмбрионов spi с помощью высоких уровней экспрессии Krn показывает обнаруживаемые уровни dpERK только в тканях, где обычно происходит расщепление Spi.Удивительно, но в отличие от Spi, Krn способен вызывать фенотипы в различных тканях после сверхэкспрессии. Напр., В крыле сверхэкспрессия Krn приводит к раздуванию крыльев, подобных тем, которые получают при умеренной активации Egfr с помощью конструкции lambda-top. Чрезмерная экспрессия в глазу приводит к грубым глазам, а в клетках фолликулов — к избытку материала дорсальных придатков. У эмбрионов экспрессия Krn вызывает эмбриональную летальность, при этом кутикулы обнаруживают расширение структур головы, но в остальном имеют нормальный внешний вид (Reich, 2002).

Более ясное понимание расщепления Spi было получено в результате исследований на клетках. Эффективное расщепление Spi происходит только в клетках, в которых экспрессируются как Star, так и Rho. Spi сохраняется в ER через его внутриклеточный домен. Стар связывает Spi и перемещает его из ER в Golgi, где Rho действует как протеаза и расщепляет Spi. Krn-GFP в клетках S2 Drosophila демонстрирует частичное высвобождение из удержания, что проявляется везикулярным распределением, что указывает на выход из ER.Функциональное значение этого наблюдалось через эктопические фенотипы в различных тканях. Напр., В то время как эктопический Spi, управляемый повсеместно распространенным GAL4 у эмбрионов, не предотвращает вылупление личинок, эктопический Krn приводит к летальному исходу. Это подчеркивает важность удерживания, поскольку оно позволяет экспрессировать большое количество белка Spi в клетке, но контролирует активность Spi, предотвращая попадание Spi в другие компартменты, где происходит расщепление (Reich, 2002).

Химерные и делеционные конструкции идентифицируют цитоплазматические домены Spi и Krn как домены, ответственные за их различные профили расщепления.Это результат разных уровней удержания в ER. Механизм удержания Spi и Krn пока не ясен. Было также показано, что Spi сохраняется в гетерологичной системе клеток млекопитающих, что подразумевает действие консервативных молекул или внутреннее свойство белка. В одной модели ассоциация цитоплазматического домена Spi с дополнительным белком (белками) может опосредовать удерживание. В этом случае можно было бы ожидать, что Krn будет иметь более низкое сродство к этому белку (белкам). В другой модели сам С-конец Spi может обладать внутренней ингибирующей способностью за счет сворачивания белка, который стерически запрещает ассоциацию с белками — это будет переносить Spi дальше по секреторному пути.В этом случае можно было бы ожидать, что Krn будет обладать более высоким сродством к таким шаперонам, что позволит ему выходить из ER без полной зависимости от Star (Reich, 2002).

По сравнению со Spi или Krn, цитоплазматический домен Grk, третьего лиганда Egfr с трансмембранным доменом, короче (всего 24 аминокислоты). Делеция его цитоплазматического домена не влияла на передачу сигналов с помощью Grk. Подобно Krn, сверхэкспрессия полноразмерного белка Grk вызывает фенотип эктопических крыльев. Было бы интересно посмотреть, в какой степени Grk сохраняется в ER клеток S2 (Reich, 2002).

Экспрессия Krn в клетках S2 позволяет проследить механизм расщепления на низком уровне, который не зависит от Star и Rho. Какая протеаза отвечает за это расщепление? Чувствительность расщепления Krn к ингибиторам сериновых протеаз указывает на то, что расщепление может быть опосредовано протеазой этого семейства. В отличие от Rho, который экспрессируется пространственно и временно регулируемым образом, протеаза, как ожидается, будет экспрессироваться повсеместно, поскольку эктопический Krn вызывает аномальные фенотипы везде, где он экспрессируется.Это дополнительно подчеркивает необходимость жесткого транскрипционного контроля экспрессии Krn (Reich, 2002).

Совместная экспрессия Star с Krn в клетках S2 увеличивает количество секретируемого sKrn в среде. Это результат эффективного экспорта Krn из ER системой Star. Поскольку более высокие уровни расщепления могут быть получены путем совместной экспрессии как Rho, так и Star, это, по-видимому, указывает на то, что протеаза, участвующая в расщеплении на низком уровне, менее эффективна, чем Rho (Reich, 2002).

Высокий уровень расщепления Krn отслеживали у эмбрионов с помощью обнаружения dpERK.Профиль активации следует за ограниченной экспрессией Rho, поскольку Star выражается широко. Только в культуре клеток Rho мог усиливать расщепление Krn без совместной экспрессии Star. Это, вероятно, происходит потому, что Krn может «просачиваться» из ER, достигать компартментов, где присутствует Rho, и подвергаться расщеплению с помощью Rho независимо от Star (Reich, 2002).

Консервация последовательности в трансмембранных доменах белка Rho предполагает, что сайт расщепления Spi будет находиться внутри трансмембранного домена.Есть также свидетельства того, что Rho расщепляет Spi внутри мембраны. Трансмембранные области Spi и Krn консервативны и демонстрируют 50% идентичность последовательностей. Таким образом, трансмембранный домен Krn может иметь те же сайты узнавания, что и Spi (Reich, 2002).

С учетом двух способов расщепления Krn, где он может играть биологическую роль? Способность Krn подвергаться Rho- и Star-зависимому расщеплению на высоком уровне предполагает, что он может обеспечивать недостающий лиганд в тканях, где фенотип rho более серьезен, чем фенотип spi .Это включает образование жилок в крыле, создание правильного расстояния между R8 и ингибирование апоптоза после морфогенетической борозды в глазном диске. В эмбрионе фенотипы spi сходны с фенотипами rho или Star мутантов, указывая тем самым, что Krn, скорее всего, не требуется на этой стадии (Reich, 2002).

Может ли расщепление Krn на низком уровне также играть физиологическую роль в активации Egfr? В имагинальном диске глаза генерация клонов мутантов Egfr либо впереди, либо сзади морфогенетической борозды была невозможна из-за летальности клеток.Известные гены семейства rho не экспрессируются впереди борозды. Таким образом, возможно, что низкоуровневое расщепление Krn может обеспечивать остаточные уровни секретируемого лиганда, необходимые для запуска Egfr перед бороздкой и обеспечения выживания клеток. Низкие уровни активации Egfr впереди борозды согласуются с необнаруживаемыми уровнями dpERK в этом домене. Чтобы вызвать биологический ответ, необходимо получить достаточные уровни секретируемого лиганда, несмотря на низкий уровень экспрессии krn .В анализах неправильной экспрессии Krn, представленных в этой работе, для обнаружения этой низкой активности требовались высокие уровни экспрессии (Reich, 2002).

Чтобы изучить биологическую роль Krn, была проведена двухцепочечная (ds) РНК krn. Усилия были сосредоточены на имагинальных дисках глаза и крыльев, где ожидается активность Krn. Равномерная экспрессия дцРНК krn в этих тканях, даже в сочетании с дцРНК spi , не давала заметного фенотипа.Возможная роль Krn в этих тканях может быть подтверждена только тогда, когда станут доступны мутации для krn и будут протестированы их фенотипы, отдельно или в комбинации с мутантами для spi (Reich, 2002).

В заключение, Krn оказался функциональным гомологом Spi. В отличие от Spi, Krn способен подвергаться неэффективному Star- и Rho-независимому расщеплению у мух и в культуре клеток. Это происходит из-за различий между внутриклеточными доменами Krn и Spi, которые позволяют Krn уклоняться от удерживания в ER и распространяться дальше по секреторному пути.Это требует жесткого транскрипционного контроля экспрессии Krn, в отличие от Spi, который может экспрессироваться повсеместно и обильно (Reich, 2002).

Модификации липидов, такие как пальмитоилирование или миристоилирование, нацелены на внутриклеточные белки на клеточные мембраны. Секретируемые лиганды семейств Hedgehog и Wnt также пальмитоилированы; эта модификация, для которой требуются родственные трансмембранные ацилтрансферазы Rasp (альтернативное название: Sightless) и Porcupine, может усиливать их секрецию, транспорт или активность. рашпиль также важен для онтогенетических функций Spitz, лиганда рецептора эпидермального фактора роста дрозофилы (EGFR). В культивируемых клетках Rasp способствует добавлению пальмитата к N-концевому остатку цистеина Spitz, и этот цистеин необходим для активности Spitz in vivo. Пальмитоилирование снижает секрецию шпица и усиливает его ассоциацию с плазматической мембраной, но не изменяет его способность активировать EGFR in vitro. In vivo сверхэкспрессированный непальмитоилированный шпиц имеет увеличенный диапазон действия, но пониженную активность.Эти данные предполагают роль пальмитоилирования в ограничении диффузии Spitz, позволяя его локальной концентрации достигать порога, необходимого для биологической функции (Miura, 2006).

Это исследование показывает, что ацилтрансфераза Rasp способствует пальмитоилированию Spi в дополнение к его ранее описанному субстрату Hh. rasp Мутанты демонстрируют фенотипы, подобные мутантам spi , и rasp необходим для активности эктопических sSpi, продуцируемых либо расщеплением эндогенного Spi, либо экспрессией усеченного белка.Рашпиль также необходим для гидрофобного характера Spi, экспрессируемого в клетках S2. Пальмитоилирование Spi с помощью Rasp может воспроизводиться в клетках COS, которые не содержат никакой эндогенной активности пальмитоилтрансферазы Spi; либо эти клетки не экспрессируют гомолог Rasp, либо гомолог слишком расходится, чтобы распознавать Drosophila Spi. Мутация предсказанного гистидина активного сайта Rasp блокирует включение пальмитата в Spi, предполагая, что Spi может быть прямой мишенью Rasp. Однако нельзя исключить возможность того, что другие белки, присутствующие в клетках COS, вносят вклад в активность ацилтрансферазы (Miura, 2006).

Основание для распознавания подложки с помощью Rasp неочевидно. Существует небольшая гомология последовательностей между Hh и Spi после пальмитоилированного цистеина, хотя оба белка имеют поблизости несколько основных аминокислот; Основные аминокислоты следуют за сайтом пальмитоилирования некоторых классов внутриклеточных белков. Myc-tagged Skn, мышиный гомолог Rasp, как сообщается, локализуется в эндоплазматическом ретикулуме (ER) в клетках CHO; в клетках S2 наблюдалась совместная локализация HA-Rasp с маркерами аппарата Гольджи.Если Hh и Spi пальмитоилируются в одном и том же клеточном компартменте, они позже идут разными путями; Hh высвобождается из клетки за счет активности мембранного белка Dispatched, тогда как Spi требует Star для экспорта из ER и затем активируется посредством Rho-опосредованного расщепления. Поскольку sSpi может быть пальмитоилирован, расщепление Rho не является предпосылкой для пальмитоилирования. Однако влияние пальмитоилирования на секрецию более драматично для полноразмерных Spi, чем для sSpi, это указывает на то, что пальмитоилирование может быть более эффективным, когда Spi подвергается нормальному процессингу (Miura, 2006).

рашпиль также необходим для процессов, опосредованных лигандами EGFR, отличными от Spi. Наблюдение, что отсутствие рашпиля в зародышевой линии вызывает вентрализацию клеток фолликула, предполагает, что Grk может быть пальмитоилирован. В соответствии с этой возможностью, было обнаружено, что внеклеточный домен Grk также фракционируется в слой Triton X-114 при экспрессии в клетках S2, хотя и в меньшей степени, чем Spi. Фенотип rasp является относительно мягким по сравнению с потерей grk , указывая тем самым, что Grk имеет менее строгие требования для пальмитоилирования, чем Spi (Miura, 2006).

Для развития крыловых жилок, которые затрагиваются у мутантов rasp , необходимы как Rho, так и Vein, но не Spi. Поскольку Vein не синтезируется как трансмембранный предшественник, потребность в Rho может указывать на участие Krn, лиганда, тесно связанного с Spi. Grk и Krn имеют остатки цистеина сразу после сигнального пептида, что делает их вероятными субстратами для Rasp, но Vein не имеет, что согласуется с наблюдением, что rasp не требуется для экспрессии гена-мишени Vein mirr .Неясно, подвергаются ли лиганды EGFR позвоночных подобному пальмитоилированию, поскольку ни один из известных лигандов не имеет N-концевого остатка цистеина; TGF-α пальмитоилируется двумя цистеинами в цитоплазматическом домене трансмембранного предшественника, но, вероятно, это связано с другим механизмом. Будет интересно определить, затрагивается ли передача сигналов EGFR у мышей, мутантных (Chen, 2004) по гомологу rasp Skn (Miura, 2006).

И ацилтрансфераза Rasp, и цистеин 29 важны для активности in vivo эндогенного или сверхэкспрессированного полноразмерного Spi, и оба значительно усиливают активность сверхэкспрессированного усеченного Spi.Напротив, исследования in vitro с sSpiCS ясно показывают, что потеря пальмитоилирования не влияет на связывание или активацию EGFR или на связывание Argos. Таким образом, вполне вероятно, что пальмитоилирование определяет биологически важные пространственные или временные аспекты распределения Spi, а не влияет на присущие ему связывающие свойства. В самом деле, мутация цистеина 29 либо в полноразмерном, либо в усеченном Spi позволяет лучше извлекать секретируемый Spi из среды для культивирования клеток. Кроме того, меченый sSpi дикого типа обнаруживает сильную мембранную локализацию как в клетках S2, так и в имагинальных дисках, тогда как непальмитоилированный sSpi не связан с мембраной в клетках S2 и может достигать удаленных клеток и действовать на них in vivo.Поэтому предполагается, что пальмитоилирование необходимо для поддержания высокой локальной концентрации Spi, возможно, за счет прямого связывания Spi с плазматической мембраной или позволяя ему образовывать комплекс с др. Факторами, которые ограничивают его диффузию (Miura, 2006).

Пальмитоилирование может иметь дополнительные эффекты на передачу сигналов Spi; его сильное влияние на секрецию mSpi может быть частично связано с ингибирующим действием на расщепление Spi, хотя это вряд ли приведет к увеличению активности Spi.Также возможно, что пальмитоилирование вносит вклад в эндоцитоз и рециклинг Spi, механизм, который, как сообщается, усиливает передачу сигналов Wg. Пальмитоилирование вряд ли повлияет на удержание sSpi в ER, поскольку это происходит как в клетках COS, так и в клетках S2. Кроме того, не наблюдалось эффекта пальмитоилирования на внутриклеточное распределение меченых sSpi в клетках S2 или COS (Miura, 2006).

Spi действует как сигнал ближнего действия in vivo, отчасти из-за индукции секретируемого ингибитора обратной связи Argos.Пальмитоилирование Spi не влияет на его связывание с Argos, как и ожидалось, потому что это связывание опосредуется доменом EGF Spi. Кроме того, для функции Spi требуется рашпиль даже при полном отсутствии argos . Поэтому предполагается, что высокая концентрация Spi необходима просто для достижения уровня активации EGFR, необходимого для биологической функции, независимо от присутствия Argos. Результаты подтверждают, что пальмитоилирование является механизмом, используемым для достижения этого локального накопления Spi (Miura, 2006).

Хотя все Hh, Wg и Spi несут модификации пальмитата, необходимые для их функции, пальмитоилирование, по-видимому, оказывает различное влияние на каждую молекулу. Wg, хотя и не Wnt3a, требует пальмитоилирования для своей секреции. Shh требует пальмитоилирования для включения в липопротеиновый комплекс, который усиливает его транспорт; Wg также находится в подобном комплексе. Помимо воздействия на транспорт, пальмитоилирование усиливает активность Hh в анализах, которые не требуют транспорта.Отмечено, что sSpiCS не обнаруживает доминантно-отрицательных эффектов, описанных для HhC84S, указывая тем самым, что пальмитоилирование не влияет на активность Spi таким же образом (Miura, 2006).

Пальмитоилирование внутриклеточных белков часто способствует мембранной ассоциации, хотя обычно это происходит в сочетании со второй модификацией липидов. Это повышает вероятность того, что пальмитоилированный Spi связан с плазматической мембраной, а не связывается с липопротеиновыми частицами, такими как те, которые транспортируют Hh и Wg.Если так, то будет интересно узнать, может ли связанный с мембраной sSpi напрямую связывать EGFR. Полноразмерный трансмембранный Spi, в котором домен EGF прилегает к мембране, неактивен в отсутствие ромбовидной формы, но мембранная ассоциация sSpi через его N-концевую пальмитатную группу будет размещать домен EGF на расстоянии от мембраны. Если связанный с мембраной Spi не может активировать EGFR, Spi может высвобождаться из мембраны путем депальмитоилирования. Было показано, что циклы пальмитоилирования и депальмитоилирования регулируют внутриклеточную локализацию Ras.Однако N-концевая модификация пальмитата, вероятно, будет образовывать стабильную амидную связь, как в Hh, а не лабильную тиоэфирную связь. Альтернативно, высвобождение Spi может осуществляться протеолитическим процессингом. Интересно, что было обнаружено, что последовательность sSpi дикого типа, высвобождаемая в среду из клеток S2, начинается с метионина 45, тогда как sSpiCS начинается с серина в положении 29, сразу после сигнального пептида (Miura, 2006).

Наблюдение, что пальмитоилирование Spi важно in vivo, расширяет важность этой модификации внеклеточных секретируемых белков до третьего класса лигандов.Однако его функция, по-видимому, различается между разными молекулами и видами. Дальнейшее изучение мембраносвязанных пальмитоилтрансфераз и их субстратов может дать новое понимание регуляции секреции, транспорта и активности лигандов (Miura, 2006).