Мазки из влагалища во время течки у крыс Sprague-Dawley

Мазки из влагалища во время течки у мышей

Мазки из влагалища во время течки у крыс Sprague-Dawley

Мазки из влагалища при метаструсе у мышей

Мазки из влагалища на метаструсе у крыс Sprague Dawley

Мазки из влагалища на диэструсе у мышей ( a — e ) и крыс Sprague Dawley ( f )

Гистологическое исследование репродуктивных органов

Хотя определение фаз эстрального цикла с помощью этой методики очень надежно и точно, она имеет множество недостатков. Этот метод является инвазивным и бесполезным для оценки эстрального состояния у лабораторных животных.Это также дорого и требует высокого мастерства. Кроме того, это слишком утомительно и требует много времени. Этот метод недоступен, поэтому он не применим, особенно в отдаленных районах тропического региона.

Минимальным требованием для гистологической оценки эстрального цикла являются полные продольные срезы влагалища и шейки матки, поперечные срезы средней части обоих рогов матки и средние срезы обоих яичников [6]. Наличие фолликулов яичников нельзя использовать для определения фазы течки у крыс и мышей с короткими эстральными циклами.Фолликулы почти всегда присутствуют в яичниках на всех стадиях. Однако появление определенных морфологий желтого тела может помочь в постановке, даже если оно не может быть окончательным [25]. Иссеченные органы фиксируют 10% формалином, окрашивают гематоксилином и эозином и исследуют под микроскопом.

Гистологический вид репродуктивных органов в различные эстральные фазы показан в Таблице 4 и на Рис. 11, 12, 13 и 14.

Импеданс стенки влагалища

Хотя использование электрического импеданса на стенке влагалища для определения фазы эструса является спорным и редко встречается цитируется в литературе [22], кажется, что он привлекает все больше внимания.Этот метод удобен, легкодоступен и требует меньше навыков. Этот метод гораздо менее поддается субъективной интерпретации со стороны технического специалиста, чем более традиционная методология вагинального мазка [22]. Однако он также дорог и не получил широкого распространения, возможно, из-за его ненадежности. Этот метод скорее отличает охоту от животных, не находящихся в охоте.

Монитор импеданса, используемый для этой техники, состоит из измерителя и вагинального зонда (рис. 15). Один человек удерживает животное, в то время как другой вводит вагинальный зонд примерно на 30 с для измерения импеданса [23] на экране дисплея измерителя.Перед каждым анализом зонд очищается 70% спиртом. В качестве альтернативы можно использовать простой, дешевый и портативный электросчетчик с батарейным питанием, который измеряет сопротивление в широком диапазоне, который обычно используется электриками, как описано Ramos et al. [22] При использовании этого альтернативного устройства к нему должны быть присоединены выводы, изготовленные из внутренней проводки типичного недорогого экранированного аудиокабеля, а штекерный разъем используется в качестве вагинального зонда (рис. 16).

Гистология репродуктивных органов крыс в период проэструса (Westwood, 2008)

Гистология репродуктивных органов крыс в период течки (Westwood, 2008)

Гистология репродуктивных органов крыс в Метеструсе (Westwood, 2008)

Гистология репродуктивных органов крыс на diestrus (Westwood, 2008)

Стандартный монитор импеданса

Штекерный разъем стандартного стереофонического аудиокабеля, используемого в качестве датчика для измерения сопротивления (Ramos et al., [20])

У животных в период охоты влагалищный импеданс выше, чем у животных в фазе охоты.Jaramillo et al. [21] показали, что спаривание самки с самцами животных на основе импеданса стенки влагалища привело к более высокому уровню подтвержденных спариваний, а также беременности по сравнению с парами на основе вагинального мазка. С другой стороны, Singletary et al. [23] наблюдали, что крысы в ​​фазе эструса, как было определено цитологическим исследованием влагалища, имели более высокий вагинальный импеданс, чем у крыс без эструса, но вагинальное сопротивление и фаза эстрального цикла, определенная цитологическим исследованием влагалища, не коррелировали. Большинство авторов, которые задокументировали использование импеданса стенки влагалища, подтвердили свои результаты с помощью цитологии влагалища; следовательно, не сообщалось об эталонных значениях, указывающих, находится ли животное в течке.

Биохимия мочи

Хотя этот метод оценки эстрального состояния еще не получил популярности и всеобщего признания, он является полезным инструментом. Этот метод прост, относительно дешев и не утомителен. Поскольку уровни углеводов, белков и жирных кислот в моче обычно являются ответом на эстрадиол и прогестерон; это может варьироваться в зависимости от вида и сорта. Этот метод неспецифичен и ненадежен, поскольку у некоторых животных в моче постоянно высокий уровень белка, который служит для этих животных химическими сигналами [24].

Во время оценки экспериментальное животное следует держать над часовым стеклом и делать легкий массаж живота для стимуляции мочеиспускания. Образец мочи собирают и просеивают через марлю или нейлоновую сетку (16-120 мкм) во время сбора. Образец следует хранить при –20 ° C, если его не проанализировать немедленно [24]. Углеводы, белки и липиды / жирные кислоты в моче следует анализировать стандартными методами.

Уровни белков и липидов в моче значительно выше в фазах проэструса и течки.Концентрация жирных кислот в моче также очень высока во время течки. Уровень углеводов в моче одинаков на протяжении всего эстрального цикла [24]. Как и в случае импеданса стенки влагалища, нет отчетов о стандартных значениях биохимических показателей мочи на каждой фазе эстрального цикла для обычно используемых лабораторных животных.

Вызывание эструса

При оценке сексуального поведения, особенно у самцов животных, или афродизиакального потенциала определенного агента / лекарственного средства, важно довести самок животных до искусственной эструса (фазы) / течки.Это увеличивает их восприимчивость и готовность к спариванию с самцами. Эта практика распространена в животноводстве. Это достигается путем введения суспензии этинилэстрадиола в дозе 100 мкг / животное на пероральный прием в течение 48 часов перед спариванием с аналогом мужского пола и прогестероном в дозе 1 мг / животное подкожно за 6 часов до сопоставления [26]. Альтернативно, эстрадиолбензоат в дозе 10 мкг / 100 г веса тела и прогестерон в дозе 0,5 мг / 100 г веса тела вводятся подкожно за 48 ч и 4-6 ч соответственно до спаривания [27,28,29] (Таблица 5).Фаза эструса обычно подтверждается вагинальным мазком [30]. Комбинация визуальной оценки с вагинальным мазком может установить эструс. Подтверждением эстральной фазы индуцированной самки животного является оценка ее восприимчивости. Для этого перед экспериментом / тестом их знакомят с мужчиной (не использованным в исследовании). Самкам животных с максимальной восприимчивостью разрешается спариваться.

лекция 9: эстральные циклы

Лекция 9. Репродуктивная цикличность у женщин

Чтение

Лекция 9: Эстральные циклы

Терминология

• Estrus vs.Эстральный
• Эструс и течка
• Эструс и течка — синонимы
• Анэструс
• Полиэструс
• Сезонный Полиэструс
• Моноэструс

Гормональные изменения и изменения яичников во время Эстральный цикл

Фолликулярная фаза

• Фолликулы доминирующей структуры яичников
• Эстроген — доминирующий гормон

Лютеиновая фаза

• желтые тела доминирующая структура яичников
• Прогестерон — доминирующий гормон

4 стадии эстрального цикла

• Proestrus
  • фолликул увеличивается
  • эстроген повышается
  • вазулярность женских половых путей увеличивается
  • железы эндометрия начинают расти
  • пик уровня эстрогена
• Эструс
  • позволяет устанавливать вилку
  • эстроген снижается
  • Происходит выброс ЛГ
  • овуляция через 24-48 ч после всплеска ЛГ
  • моторика матки высокая с сокращениями, движущимися к яйцеводу
  • транспорт спермы оптимален
  • Увеличивается объем цервикальной слизи
• Метеструс
  • эстроген низкий
  • геморрагическое тело присутствует
  • овуляция у коровы
  • матка
    • схваток стихают
    • железы эндометрия продолжают расти и сворачиваться
    • у крупного рогатого скота происходит кровотечение
  • ФСГ увеличивается, вызывая рост фолликулов
• Диструс
  • прогестерон высокий
  • ФСГ низкий, но в какой-то момент увеличивается, чтобы вызвать рост преовуляторного фолликула
  • матка
    • выделяет жидкость, но объем жидкости со временем уменьшается
    • остановка сокращения
    • желтое тело регрессирует в конце этого периода, если у женщины нет беременная

Эстральные циклы у собак и кошек (Рисунок 2)

• Собака
  • Анэструс — имеет повышение ФСГ, которое вызывает рост фолликулов
  • Проэструс — повышение эстрадиола и пики в конце, также начинаются кровянистые выделения
  • Эструс — эстрадиол снижается, выброс ЛГ, овуляция, прогестерон увеличивается еще до овуляции
  • Metestrus I — 20 дней, прогестерон высокий, повышение эстрадиола
  • Metestrus II — 70 дней, прогестерон снижается, эстрадиол снижается, пролактин увеличивается, а затем снижается
  • Узоры одинаковые у беременной и небеременной суки
  • Псевдобеременность наступает у небеременной суки из-за повышения уровня пролактина.
• Кошка
  • Эструс 9 дней, Проэструс 8 дней, повторяется до спаривания, течка при наличии эстрадиола, прогестерон низкий на протяжении
  • После спаривания, вызванный выбросом ЛГ, прогестерон увеличивается, затем уменьшается, течка возвращается после родов, когда прогестерон снова снижается.

Причины анэструса

• Беременность
• Наличие потомства
• сезон
• напряжение
• патология

Особые типы анэструса

• Гестационные
  • Нормальный
  • желтое тело присутствует во время беременности
    • прогестерон оказывает негативное влияние на гонадолиберин
      • ЛГ и ФСГ не повышаются
      • эстроген остается от низкого до умеренного
      • эстроген оказывает негативное влияние на обратную связь в присутствии прогестерона
  • желтое тело регрессирует до родов, но гипоталамус все еще регрессирует не увеличивать частоту и амплитуду импульсов гонадолиберина в течение некоторого времени
    • из-за длительного угнетения гипоталамуса во время беременности
    • полезен при инволюции матки до первого послеродового периода эстральный цикл
• Сезонно (Рисунок 3; Рисунок 4; Рисунок 5)
  • лошадей — заводчики длинного дня, овцы — заводчики короткого дня
  • от анэструса до полового созревания
    • эстрадиол оказывает отрицательное действие при анэструсе и гипоталамусе чувствительность к эстрадиолу переключается на положительную обратную связь, чтобы вызвать повышение в ЛГ, пока не произойдет всплеск
  • течка к анэструсу
    • во время нормального эстрального цикла эстрадиол имеет негативные эффекты обратной связи когда присутствует прогестерон
    • после снижения прогестерона повышается уровень ЛГ, повышается уровень эстрадиола и теперь эстрадиол имеет положительный эффект обратной связи для стимуляции большего количества ЛГ до тех пор, пока происходит всплеск
• Лактационный
  • Самки, кормящие грудью молодых, испытывают анэструс
    • Свиноматка — полностью подавляет течку
    • Корова — туша до 60 дней
      • частота сосания (необходимо не менее 2 раз в день)
      • не из-за стимуляции сосков
        • зрительный, обонятельный или, возможно, слуховой контакт
      • потенциальная роль пролактина
        • пролактин ингибирует высвобождение гонадолиберина
        • основная проблема бесплодия у не кормящих женщин
• Пищевая ценность
  • Отрицательный энергетический баланс может вызвать анэструс
    • похож на период полового созревания в том, что подавляет частоту импульсов гонадолиберина из-за недостаточного доступная энергия
    • помните эффекты инфузии 2 дезоксиглюкозы в том смысле, что она подавляет гонадолиберин. релиз
  • Проблема у первородящих самок с комбинированной потребностью в лактации и рост

Менструальный цикл у женщин (рис. 6) (Концептуальный наставник по менструальному циклу) Циклы)

• Средняя продолжительность цикла составляет 28 дней от начала менструации до начала следующей менструации
• Яичниковые события
  • Фолликулярная волна начинается 1-2 дня с последующим набором по отбору и доминированию
  • Овуляция наступает на 14 день
  • CL формируется и длится 12-14 дней
    • лютеолиз не зависит от матки
    • CL запрограммирован на работу всего 12-14 дней и регрессирует если женщина не беременна
• Стероиды яичников
• По мере того, как фолликулы начинают расти во время отбора и доминирования, эстрадиол секретируется третичными фолликулами.Этот эстрадиол изначально оказывает негативное влияние на гипоталамус и передней доли гипофиза, чтобы ингибировать высвобождение гонадолиберина и его влияние на передний гипофиз. Примерно на 10 день эстрадиол начинает снижаться. положительные отзывы о гипоталамусе и передней доле гипофиза. Это вызывает выбросы ГнРГ и ЛГ, вызывающие овуляцию.
• Cl у приматов продуцирует как эстрадиол, так и прогестерон
• лютеолиз вызывает снижение как эстрадиола, так и прогестерона и инициирует менструацию
• Гонадотропины
  • Повышение уровня ФСГ вызывает фолликулярную волну на 1-2 день, а уровень ЛГ снижается. низкий в это время.
  • ФСГ затем снижается
  • Положительный результат воздействия эстрадиола вызывает повышение уровня ЛГ в течение дня 10 и всплеск происходит на 13 день с овуляцией на 14 день.
  • ЛГ и ФСГ затем снижаются и остаются на низком уровне до конца цикла
• Маточные явления
  • в первый день начинается менструация с потерей эндометрия матки ткань
  • по мере окончания менструации эндометрий матки начинает разрастаться под действием эстрадиола из растущих фолликулов
  • после овуляции и образования ХЛ, эстрадиола и прогестерона от CL вызывают дальнейшее разрастание эндометрия матки
  • Лютеолиз на 25-27 день приводит к снижению как эстрадиола, так и прогестерон, вызывающий сначала сужение кровеносных сосудов к эдометрий матки с последующим расширением.Недостаток кислорода и питательных веществ из кровеносных сосудов приводит к гибели ткани эндометрия и затем кровеносные сосуды кровоточат. Сгустки крови, а затем разжижение. Менструальный поток состоит как из сыворотки, так и из остатков ткани эндометрия.
• Части цикла, для среднего цикла (Рисунок 7)
  • Менструации — 5 дней
  • Фолликулярная фаза — 9 дней
  • Лютеиновая фаза — 14 дней
• Изменение длины цикла (Рисунок 8)
  • Характеристики
    • менструация не меняется, ок.5 дней
    • лютеиновая фаза не меняется, прим. 14 дней
    • фолликулярная фаза может быть переменной
      • 6 дней для 25-дневного цикла
      • 9 дней для 28-дневного цикла
      • 16 дней для 35-дневного цикла
    • болезненность груди возникает за 5-7 дней до менструации
      • действие прогестерона и эстрадиола на развитие тканей груди
      • лактация не наступает из-за низкого уровня пролактина
  • Влияние возраста
    • Длина (средняя)
      • 35 дней для детей 15-19 лет
      • 30 дней для 30-летних
      • 28 дней для 35-летних
    • Вариант
      Еще
      • у подростков
      • меньше для женщин в пик репродуктивного возраста
• Влияние лактации на послеродовой менструальный цикл
  • Отсутствие лактации, 50% езда на велосипеде к 8 месяцам, 90% езда на велосипеде к 12 месяцам
  • Кормление (в течение 24 месяцев), 30% езда на велосипеде к 12 месяцам, 70% езда на велосипеде к 24 месяцам

Обзор викторин

Инструмент идентификации эстрального цикла мыши и изображения

Abstract

Эффективность получения беременных или псевдобеременных мышей с определенным сроком беременности может быть увеличена путем выявления тех, кто находится в проэструсе или эструсе.Визуальное наблюдение за влагалищем — самый быстрый метод, не требует специального оборудования и лучше всего используется, когда необходимо определить только стадии проэструса или течки. Различия в деформации, особенно в цвете шерсти, могут затруднить точное определение стадии эстрального цикла при визуальном наблюдении. Здесь представлены серии изображений входа во влагалище на каждой стадии эстрального цикла для 3 линий мышей разного цвета шерсти: черного (C57BL / 6J), агути (CByB6F1 / J) и альбиноса (BALB / cByJ).Когда необходимо определить все 4 стадии (проэструс, эструс, метэструс и диэструс), наиболее точным методом считается вагинальная цитология. Инструмент идентификации представлен, чтобы помочь пользователю определить стадию течки при использовании вагинального цитологического исследования. Эти изображения и описания — отличный ресурс для изучения того, как определить стадию эстрального цикла с помощью визуального наблюдения или цитологического исследования влагалища.

Образец цитирования: Байерс С.Л., Уайлс М.В., Данн С.Л., Тафт Р.А. (2012) Инструмент и изображения для идентификации эстрального цикла мыши.PLoS ONE 7 (4): e35538. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0035538 ​​

Редактор: Шри Рам Сингх, Национальный институт рака, Соединенные Штаты Америки

Поступила: 20 января 2012 г .; Принята к печати: 19 марта 2012 г .; Опубликовано: 13 апреля 2012 г.

Авторские права: © 2012 Byers et al. Это статья в открытом доступе, распространяемая в соответствии с условиями лицензии Creative Commons Attribution License, которая разрешает неограниченное использование, распространение и воспроизведение на любом носителе при условии указания автора и источника.

Финансирование: У авторов нет поддержки или финансирования, чтобы сообщить.

Конкурирующие интересы: Авторы заявили об отсутствии конкурирующих интересов.

Введение

Определение стадии течки полезно для выбора мышей, которые будут спариваться в паре с самцом (чтобы произвести запланированную беременность или псевдобеременность) или для отслеживания стадии течки как переменной, которая может повлиять на исследования. У мышей эстральный цикл разделен на 4 стадии (проэструс, эструс, метэструс и диэструс) и повторяется каждые 4-5 дней, если он не прерван беременностью, псевдобеременностью или анэструсом.Цикл был подробно описан в другом месте, и читатель может найти полное описание в этих ссылках [1], [2].

Изменения, происходящие в эстральном цикле мыши, очевидны в физиологии и анатомии животного. Эти изменения могут быть обнаружены с помощью различных методов определения стадии течки, включая оценку цитологии влагалища [1], [3], [4], [5], измерение электрического импеданса [6], биохимический анализ мочи [7] ], а также визуальное наблюдение за наружными гениталиями [8].Оценка вагинальных клеток считается наиболее точным методом определения всех стадий эстрального цикла, однако это относительно трудоемкий процесс, требующий сбора вагинальных клеток, переноса на предметное стекло, сушки на воздухе, окрашивания и просмотра. Метод вагинальной цитологии лучше всего использовать, когда необходимо идентифицировать все 4 стадии эстрального цикла. В качестве альтернативы, электрический импеданс слоя эпителиальных клеток влагалища во время проэструса выше, чем во время других стадий, и его можно измерить с помощью зонда для идентификации мышей, находящихся в проэструсе.Однако одним ограничением является то, что с помощью этого метода невозможно различить другие стадии полового акта. Метод определения стадии течки путем визуального наблюдения, описанный Champlin и др. [8], значительно быстрее, чем методы цитологии или электрического импеданса. После того, как человек будет обучен, примерно 100 женщин могут быть обследованы за 10–15 минут, дополнительное оборудование не требуется, и оценку можно провести, не покидая вивария. Кроме того, при визуальной оценке отсутствует риск возникновения псевдобеременности или повреждения эпителия влагалища, как это может быть при введении тампона для сбора клеток или зонда для измерения электропроводности.Мыши, идентифицированные как находящиеся в проэструсе или эструсе, вероятно, будут восприимчивы к самцам, что делает этот метод хорошо подходящим для идентификации мышей, которые могут спариваться, облегчая спаривание по времени. В группе репродуктивных наук лаборатории Джексона более 90% мышей, «отобранных» как находящихся в проэструсе или эструсе, успешно спариваются в течение ночи.

Псевдобеременные беспородные мыши-альбиносы (CD-1) или гибридные агути часто используются в качестве реципиентов эмбрионов, и выявить проэструс / течку у этих штаммов несложно.Однако цвет шерсти не является первоочередной задачей при выборе штаммов или штаммов-реципиентов эмбрионов для спаривания или искусственного оплодотворения. В этих ситуациях полезно уметь определять стадию течки у штаммов разного цвета шерсти.

Изучение методов визуальной идентификации и цитологии требует практики. Здесь представлены инструменты, которые помогут пользователю определить стадии эстрального цикла у штаммов альбиносов, чернокожих и агути при использовании метода визуального наблюдения. Метод визуального наблюдения лучше всего подходит для идентификации животных, находящихся в проэструсе или эструсе, с целью получения спарившихся по времени или псевдобеременных мышей.Для тех, кому необходимо точно идентифицировать все стадии эстрального цикла, рекомендуется метод вагинальной цитологии, а также предоставляется инструмент идентификации эстрального цикла, чтобы помочь пользователям определить правильную стадию на основе типа и доли клеток в мазке.

Материалы и методы

Заявление об этике

Институциональный комитет по уходу и использованию животных лаборатории Джексона одобрил все процедуры, использованные в этом исследовании, и все мыши содержались в лаборатории Джексона (Бар-Харбор, штат Мэн, США) в соответствии со всеми институциональными протоколами и Руководством по уходу и использованию. лабораторных животных.

Мыши

следующих линий: C57BL / 6J (инвентарный номер 000664), CByB6F1 / J (инвентарный номер 100009) и BALB / cByJ (инвентарный номер 001026). Всех мышей содержали в безбарьерных помещениях с фотопериодом 14 часов света и 10 часов темноты (свет включается в 5:00 утра). Мышей содержали в поликарбонатных двойных клетках для мышей, по 5 с каждой стороны с подстилкой из сосновой стружки, и им давали пищу (LabDiet® 5K52, Сент-Луис, Миссури, США) и воду (подкисленную) ad libitum. Использовали взрослых мышей в возрасте 9–13 недель (C57BL / 6J), 14–23 недель (CByB6F1 / J) и 8–12 недель (BALB / cByJ).

Определение стадии эстрального цикла

Репрезентативные фотографии и микрофотографии для каждой стадии эстрального цикла были получены после следующих этапов: 1. Было проведено предварительное наблюдение за стадией эстрального цикла путем оценки открытия влагалища каждой мыши, 2. Стадия эстрального цикла была определена. проверено вагинальной цитологией, 3. стадия эстрального цикла была подтверждена спариванием мышей в течение ночи и проверкой овуляции на следующее утро, как описано ниже.

Эти шаги также можно использовать для изучения визуального метода и тренировки глаза распознавать каждую стадию. Проэструс и эструс легче определить визуальным наблюдением, чем метэструс и диэструс. Цвет шерсти и пигментация кожи могут затруднить оценку некоторых штаммов. Легче наблюдать изменения у штаммов агути и альбиносов, чем у черных штаммов, у которых изменения входа во влагалище менее заметны.

Визуальный метод

Чтобы оценить стадию эстрального цикла путем визуального наблюдения, каждую мышь держали за хвост, опираясь передними лапами на крышку клетки.Открытие влагалища каждой женщины оценивали на основе критериев, описанных Champlin, et al. Цифровое изображение каждой мыши было получено с помощью цифровой камеры DSCF707 Cyber-shot (Sony, Япония). Дополнительное освещение для фотографий обеспечивалось оптоволоконным светом (Fiber Lite MI-150, Dolan-Jenner Industries, Boxborough, MA).

При оценке стадии эстрального цикла с помощью визуального метода важно всегда оценивать животных в одной и той же зоне с точки зрения освещения комнаты.Стол или рабочее место всегда должны быть обращены в одном направлении и должно быть достаточно света. Источник света также важно учитывать, поскольку он может изменить воспринимаемый цвет тканей влагалища и затруднить оценку. Переносные фонари можно приобрести и прикрепить к рабочим станциям и перемещать по мере необходимости. Однако следует избегать использования светодиодных фонарей, поскольку они имеют фиолетовый оттенок, что затрудняет визуальное обнаружение. Для этого исследования в виварии использовались люминесцентные лампы мощностью 4 Вт с батарейным питанием (Maverick, Edison, NJ).В лаборатории для освещения использовались люминесцентные потолочные светильники Sylvania Octron мощностью 32 Вт (Сильвания, Данверс, Массачусетс).

Влагалище мышей во время проэструса характеризуется опухшей влажной тканью розового цвета. Отверстие широкое, по дорсальному и вентральному краям часто видны морщинки или бороздки. Когда мышь вступает в течку, отверстие влагалища становится менее розовым, менее влажным и менее опухшим. Для Metestrus характерно то, что отверстие влагалища не раскрывается широко, не набухает, и на нем могут быть видны белые клеточные остатки.При диэструсе отверстие влагалища маленькое и закрытое без отека тканей.

Метод вагинальной цитологии

Вагинальный мазок собирали с использованием тампона с ватным наконечником (Puritan Medical Products Company, LLC Guilford, ME), смоченного физиологическим раствором при температуре окружающей среды, и вводили во влагалище удерживаемой мыши. Тампон осторожно повернули и прикатили к стенке влагалища, а затем удалили. Клетки переносили на сухое предметное стекло, катая тампон по предметному стеклу.Слайд сушили на воздухе и затем окрашивали примерно 400 мкл красителя (Accustain, Sigma-Aldrich, Сент-Луис, Миссури) в течение 45 секунд. Предметные стекла ополаскивали водой, покрывали покровным стеклом и сразу просматривали при 200-кратном увеличении при освещении ярким полем. Стадия эстрального цикла определялась на основании наличия или отсутствия лейкоцитов, ороговевших эпителиальных и ядерных эпителиальных клеток согласно Felicio и др. [9].

Когда самка находится в проэструсе, в основном присутствуют ядросодержащие и некоторые ороговевшие эпителиальные клетки.Некоторые лейкоциты могут присутствовать, если у самки начался ранний проэструс. По мере того как стадия цикла приближается к течке, в основном появляются ороговевшие эпителиальные клетки. Если цикл не прерван беременностью, псевдобеременностью или другими явлениями, начнется метеструс. Метеструс — это короткая стадия, когда желтое тело формируется, но не может полностью лютеинизироваться из-за недостатка прогестерона. Слизистая оболочка матки начнет отслаиваться, и свидетельство этого проявляется в виде ороговевших эипителиальных клеток и полиморфно-ядерных лейкоцитов, присутствующих в мазках из влагалища.Некоторые ядросодержащие клетки эпителия также будут присутствовать в позднем метструсе. Диэструс — самый продолжительный из этапов, длящийся более 2 дней. Вагинальные мазки во время диэструса показывают в основном полиморфноядерные лейкоциты и несколько эпителиальных клеток во время позднего диэструса. Лейкоциты остаются преобладающим типом клеток, удаляя клеточный мусор. Затем цикл повторяется.

Определение наступления овуляции

После определения стадии эстрального цикла каждую мышь спаривали с одним самцом CByB6F1 / J, и на следующее утро отмечали наличие или отсутствие вагинальной пробки, и каждую мышь умерщвляли путем смещения шейки матки.Содержимое яйцеводов смывали средой M2 в чашку Петри для поиска ооцитов как свидетельства того, что овуляция произошла.

Как использовать инструмент определения эстрального цикла

Инструмент идентификации эстрального цикла был разработан с использованием качественных данных из литературы [5], [9], [10] для доли каждого типа клеток в мазке. Графическое представление существующих данных было создано для представления типичных изменений типов клеток, которые происходят в течение всего эстрального цикла.Постоянные изменения типов клеток (лейкоциты, ядерный эпителиальный и ороговевший эпителий), происходящие во время эстрального цикла, приводят к отсутствию четких границ между стадиями и могут затруднить определение стадии эстрального цикла. Например, цитология влагалища мыши в период течки характеризуется множеством ороговевших клеток эпителия. Однако, если мышь находится в ранней течке, также могут присутствовать ядерные эпителиальные клетки. Здесь (рис. 1) представлен инструмент идентификации эстрального цикла, который показывает изменения в популяциях клеток в течение всего цикла.Инструмент идентификации эстрального цикла дает понять, какие типы клеток присутствуют в каждой точке цикла, включая переходные фазы между каждой стадией.

Рис. 1. Инструмент идентификации стадии эстрального цикла.

Этот инструмент представляет собой визуальное представление типов клеток и относительной пропорции каждого типа, присутствующей на четырех стадиях эстрального цикла. Линии в круге отмечают изменение стадии эстрального цикла. Размер каждого квадранта (между 2 строками) является приблизительной оценкой длины каждого этапа.Полный цикл занимает около 4–5 дней. Чтобы использовать эту таблицу, исследуют вагинальные клетки и определяют относительное количество клеток каждого типа. Затем на график помещается воображаемая стрелка, конец которой находится в центре графика, как стрелка на часах. Стрелка перемещается по часовой стрелке, пока под стрелкой не появятся типы и пропорции ячеек. Как только стрелка размещена, она указывает на соответствующую стадию течки. Например, стрелка в положении «9 часов» представляет мазок из влагалища со всеми лейкоцитами и диэструсом мыши.Стрелка у отметки «3 часа» представляет мазок с приблизительно наполовину ороговевшими эпителиальными и наполовину ядросодержащими эпителиальными клетками и мышью в проэструсе.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0035538.g001

Инструмент идентификации эстрального цикла — это наглядное пособие, которое показывает 4 стадии эстра и относительную долю клеток, присутствующих на каждой стадии. Каждый тип ячеек отображается разным цветом. Название каждой стадии эстрального цикла показано на внешней стороне круга, переходящего от одной стадии к другой по часовой стрелке.Четыре квадранта имеют разные размеры, чтобы представить приблизительную оценку того, сколько времени проводится на каждой стадии эстрального цикла.

Чтобы использовать инструмент идентификации эстрального цикла, соберите клетки с помощью описанного метода вагинальной цитологии и просмотрите их с помощью сложного микроскопа. Определите типы ячеек, представленных на слайде, и отметьте относительную долю каждого типа ячеек. Например, на предметном стекле могут быть все лейкоциты или примерно половина ороговевших эпителиальных и примерно половина ядерных эпителиальных клеток.Затем посмотрите на инструмент идентификации эстрального цикла (рис. 1) и поместите на график воображаемую стрелку так, чтобы ее конец находился в центре графика, как стрелка на часах. Стрелка перемещается по часовой стрелке, пока под стрелкой не появятся типы и пропорции ячеек. Как только стрелка размещена, она указывает на соответствующую стадию течки.

Этот инструмент позволяет легко определить стадию цикла при вагинальном цитологическом исследовании. Относительное количество и тип клеток, присутствующих во время раннего проэструса и позднего метэструса, аналогичны.Ядроядерные эпителиальные клетки в проэструсе часто хорошо сформированы, но часто имеют неправильную форму и вакуолизированы в метэструсе [3]. Как вариант, ранний проэструс и поздний метэструс можно отличить визуальным методом.

Результаты

Представлены репрезентативные фотографии (рисунки 2, 3 и 4) и изображения (рисунок 5) каждой эстральной стадии для 3 штаммов. Всех мышей оценивали визуально, и стадию эстрального цикла каждой подтверждали цитологическим исследованием влагалища. Мы оценили примерно 50 мышей на линию и выбрали репрезентативные изображения, которые были четкими и точными в отображении каждой стадии.Изображения на рисунках 2, 3 и 4 представляют различные стадии. Для каждой стадии в каждом штамме фотография и микрофотография взяты либо с одной мыши, либо с двух мышей.

Рис. 5. Цитология влагалища, представляющая каждую стадию течки.

Идентифицированы три типа клеток: лейкоциты (кружок), ороговевший эпителиальный (черная стрелка) и ядерный эпителиальный (белая стрелка). Стадии течки включают проэструс (A), течку (B), метструс (C), диэструс (D).

https: // doi.org / 10.1371 / journal.pone.0035538.g005

Для мышей на представленных фотографиях у всех мышей с проэструсом и эструсом были ооциты или кумулюсные комплексы ооцитов в их яйцеводах как свидетельство овуляции. Все мыши с метаструсом и диэструсом не имели ооцитов в яйцеводах.

Для мышей на фотографиях, показанных для каждой линии, у мышей с проэструсом и эструсом присутствовали вагинальные пробки после того, как они были помещены на ночь с самцом CByB6F1 / J, за исключением мышей с течением CByB6F1 / J (показано на Фигуре 3B).Копулятивной пробки у этой самки не обнаружено, но в яйцеводе были обнаружены ооциты, свидетельствующие о наступлении овуляции и подтверждающие вывод о том, что у нее была течка. Самец мог не спариваться или вилка выпала раньше, чем это можно было заметить. У всех мышей metestrus и diestrus, показанных на фотографиях, не было вагинальных пробок после размещения на ночь, за исключением metestrus CByB6F1 / J (показано на рисунке 3C) и мыши metestrus C57BL / 6J (показано на рисунке 4C). У этих мышей были вилки.Одно из объяснений состоит в том, что эти мыши находились в поздней течке / раннем метструсе во время спаривания, и самец спаривался сразу после того, как они были введены. На следующее утро в яйцеводе этих мышей не было обнаружено кумулюсных ооцитов, что указывает на правильность оценки метеструса. Другое объяснение — это чрезмерное рвение самцов, которые спаривались вне зависимости от стадии течки.

Обсуждение

Спаривания по времени полезны, когда необходимы эмбрионы определенной стадии, когда необходимо точно предсказать, когда мыши родятся, или для получения псевдобеременных мышей для переноса эмбрионов или искусственного оплодотворения.Обычной практикой является случайное спаривание мышей для получения спариваний по времени или псевдобеременности. Однако случайная вязка неэффективна. Использование метода визуального наблюдения резко увеличивает количество успешно спаривающихся мышей. Определить стадию эстрального цикла визуальным наблюдением просто и легко. Визуальный метод обнаружения лучше всего подходит для выявления самок проэструса и течки. При использовании одного этого метода бывает трудно различить другие стадии. Если необходимо точно определить все стадии, рекомендуется метод вагинальной цитологии с использованием инструмента идентификации эстрального цикла.

Представленные методы и изображения призваны помочь в изучении того, как определять стадию эстрального цикла. Изображения разных штаммов шерсти будут полезны тем, кто изучает метод визуального наблюдения с любым штаммом. Инструмент идентификации эстрального цикла поможет тем, кто использует метод вагинальной цитологии.

Благодарности

Спасибо Сьюзан Сарджент, которая освоила технику визуальной идентификации проэструса / эструса у мышей C57BL / 6J и предоставила животных из производственной колонии для этого исследования.

Вклад авторов

Задумал и спроектировал эксперименты: SLB MVW SLD RAT. Проведены эксперименты: SLB SLD. Проанализированы данные: SLB SLD RAT. Написал бумагу: SLB.

Список литературы

1. 1. Аллен Э. (1922) Эстральный цикл у мышей. Американский журнал анатомии 30: 297–371.
2. 2. Бронсон Ф. Х., Дагг С. П., Снелл Г. Д. (1966) Воспроизведение. В: Грин Э.Л., редактор. Биология лабораторной мыши. 2-е изд. Нью-Йорк: Книжная компания McGraw-Hill.С. 187–204.
3. 3. Нельсон JF, Felicio LS, Randall PK, Sims C, Finch CE (1982) Продольное исследование эстральной цикличности у стареющих мышей C57BL / 6J: I. Частота цикла, длина и цитология влагалища. Biol Reprod 27: 327–339.
4. 4. Грин Э., редактор. (1968) Биология лабораторной мыши. 2-е изд.
5. 5. Caligioni CS (2009) Оценка репродуктивного статуса / стадий у мышей. Текущие протоколы в неврологии.
6. 6. Ramos SD, Lee JM, Peuler JD (2001) Недорогой измеритель для измерения различий в электрическом сопротивлении во влагалище крысы во время яичникового цикла.Журнал прикладной физиологии 91: 667.
7. 7. Ачираман С., Арчунан Г., Санкарганеш Д., Раджагопал Т., Ренгараджан Р.Л. и др. (2011) Биохимический анализ мочи самок мышей в отношении эндокринной функции: ключевой инструмент для определения течки. Zoolog Sci 28: 600–605.
8. 8. Чамплин А.К., Дорр Д.Л., Гейтс А.Х. (1973) Определение стадии эстрального цикла у мышей по внешнему виду влагалища. Biol Reprod 8: 491–494.
9. 9. Felicio LS, Nelson JF, Finch CE (1984) Продольные исследования эстральной цикличности у стареющих мышей C57BL / 6J: II.Прекращение цикличности и продолжительность стойкого ороговения влагалища. Biol Reprod 31: 446–453.
10. 10. Снелл Г.Д., Дагг С.П., Бронсон Ф.Х. (1966) Биология лабораторной мыши ;. В: Грин Э.Л., редактор. Нью-Йорк: Dover Publications, Inc.

Эстральный цикл и сезонность у овец и коз

Определение эстрального цикла

Эстральный цикл обычно определяется как серия физиологических событий, происходящих между периодами течки, где течка — это время сексуальной восприимчивости или тепла1.Самки, у которых наблюдается течка или цикл несколько раз в течение определенного периода, считаются многоэстральными видами. Некоторые самки будут ходить круглый год, в то время как у других, например овец и коз, течка проявляется в течение определенного сезона. Пик половой активности у овец и коз приходится на осенние месяцы, что делает их сезонно-многоэластичными видами.

Продолжительность полового цикла у овец в среднем составляет 17 дней, но может варьироваться от 14 до 19 дней. Средняя продолжительность течки составляет от 24 до 36 часов, при этом овуляция происходит ближе к концу охоты или примерно через 24 часа после начала охоты.У коз продолжительность полового цикла составляет в среднем 21 день, но может варьироваться от 18 до 24 дней. Средняя продолжительность течки 36 часов. Однако стадия течки может длиться от 12 до 48 часов, в зависимости от породы и факторов окружающей среды, таких как присутствие самца и время года. Овуляция, как правило, происходит ближе к концу течки, хотя она может произойти от девяти до 72 часов после начала течки.

Связь между гормонами

Связь между мозгом и репродуктивным трактом устанавливается многими гормонами.Вот некоторые из основных репродуктивных гормонов, ответственных за события эстрального цикла:

Гонадотропин-рилизинг-гормон (GnRH) — продуцируется гипоталамусом в головном мозге. Его основная функция — стимулировать выработку лютеинизирующего гормона (ЛГ) и фолликулостимулирующего гормона (ФСГ) передней долей гипофиза.

Лютеинизирующий гормон (ЛГ) — продуцируется передней долей гипофиза в головном мозге в ответ на гонадолиберин. Две основные функции ЛГ — способствовать образованию желтого тела на яичнике и стимулировать овуляцию.

Фолликулостимулирующий гормон (ФСГ) — вырабатывается передней долей гипофиза в головном мозге в ответ на гонадолиберин. Как следует из названия, основная функция ФСГ — стимулировать рост фолликулов на яичниках. Самый большой и доминирующий фолликул называется фолликулом Граафа и будет фолликулом, который овулирует. У коз может быть более одного фолликула, созревшего в фолликул Граафа, что вызывает множественные овуляции для развития двойни, тройни и т. Д.

Эстроген (E ₂ ) — продуцируется фолликулами на яичниках.По мере роста фолликул вырабатывает большее количество эстрогена. Доминирующий фолликул, называемый фолликулом Граафа, производит больше всего эстрогена и в конечном итоге становится фолликулом, который овулирует. Эстроген также стимулирует тепло или сексуальную восприимчивость во время течки.

Прогестерон (P ₄ ) — продуцируется желтым телом яичника. После овуляции фолликул превращается в желтое тело в ответ на ЛГ. Желтое тело вырабатывает прогестерон на протяжении большей части эстрального цикла.Прогестерон выполняет множество функций, но в первую очередь он помогает поддерживать беременность (например, беременность), когда происходит зачатие. Прогестерон также подавляет выработку ГнРГ, ЛГ, ФСГ и эстрогена через механизмы отрицательной обратной связи.

Простагландин (PG или PGF _2α ) — продуцируется маткой, когда беременность не наступает. Он разрушает желтое тело и останавливает выработку прогестерона. Это позволяет фолликулам снова развиваться и увеличивает выработку эстрогена.Следовательно, если простагландин вводится во время беременности, он может вызвать аборт.

Понимание сезонности

У сезонно-полиэстровых видов гормон мелатонин регулирует выработку гонадолиберина. Коз и овец, а также оленей называют заводчиками короткого дня, потому что они демонстрируют пик сексуальной активности в течение осенних месяцев. Более длинные ночи в осенние и зимние месяцы стимулируют повышенную выработку мелатонина шишковидной железой головного мозга. Затем мелатонин стимулирует повышение уровня гонадолиберина в гипоталамусе, чтобы запустить курс гормонов, участвующих в эстральном цикле.

Когда световой день увеличивается, а ночи становятся короче, вырабатывается меньше мелатонина. Снижение мелатонина соответствует снижению GnRH. Следовательно, эстральные циклы становятся нерегулярными или полностью прекращаются, пока снова не произойдет падение. Животные, у которых отсутствует или не наблюдается регулярных периодов течки, считаются находящимися в периоде анэструса. В частности, поскольку большинство овец и коз не проявляют признаков сексуальной восприимчивости в весенние и летние месяцы, они переживают период сезонной анэструса.Следует отметить, что некоторые породы овец имеют тенденцию регулярно проявлять течку в течение года. Это особенно характерно для волосяных пород, таких как овцы Дорпер, в тропическом и субтропическом климате.

Резюме

Понимание гормонов и физиологических процессов, вовлеченных в половой цикл овец и коз, может улучшить управление стадом, установив сезон размножения в наиболее подходящее время. Это также дает основу для использования соответствующего протокола синхронизации течки для определения времени искусственного оплодотворения или разведения естественным путем.Все это может помочь снизить трудозатраты, повысить эффективность управления и увеличить прибыль от стада или стада.

Список литературы

_{¹ Зенгер, П. Л. Пути к беременности и родам . Под редакцией П. Л. Сенгера. 3-е изд .: Current Conceptions, Inc., 2015.}

границ | Стадия цикла эструса важна для интерпретации поведения самок мышей при социальном взаимодействии

Введение

В 1993 году ученые NIH решили потребовать включения женщин в клинические испытания в соответствии с Законом NIH Revitalization Act (NRA), утверждая, что исключение женщин из клинических исследований проблематично из-за широких последствий биологических половых различий.NRA доказала свою успешность в этой области — за годы, прошедшие с момента ее создания, участники клинических исследований почти достигли гендерного паритета. К сожалению, в исследованиях на животных сохраняется предвзятость по признаку пола, как утверждается в примечании Национального института здоровья (2015) Guide (NOT-OD-15-102). Самки животных по-прежнему обычно исключаются на том основании, что они по своей природе более изменчивы, чем самцы, из-за колебаний гормонов в течение их цикла течки, который обычно длится у мышей 4 дня (Beery and Zucker, 2011).Хотя вопрос о влиянии цикла течки на поведение полностью не изучен, исследователи по-прежнему часто ссылаются на потенциальную изменчивость, которую он может внести, как на главную причину исключения самок животных (Prendergast et al., 2014).

Исключение самок животных из исследований имеет широкие разветвления в биомедицинских и нейробиологических исследованиях. Несмотря на известные половые различия в распространенности и проявлениях некоторых психоневрологических расстройств, включая депрессию и тревожные расстройства, самцы животных часто используются в нейробиологии и поведенческих исследованиях, за исключением самок (Beery and Zucker, 2011).Кроме того, во многих статьях из разных областей вообще не сообщается пол субъектов исследования, не относящихся к человеку (Kilkenny et al., 2010; Beery and Zucker, 2011). Распространенность этого предубеждения по признаку пола опровергает слишком распространенное предположение о том, что данные, полученные от мужчин, могут быть напрямую переведены на женщин. Учитывая обычно наблюдаемые половые диморфизмы в нескольких психоневрологических и поведенческих областях, исследователи, которые включают животных только одного пола, могут ошибочно обобщать эффекты, связанные с полом, и не замечать других.

Учет поведенческих различий, связанных с циклом течки, остается важным шагом в поощрении исследователей использовать животных обоих полов. Обширная литература, каталогизирующая такие поведенческие половые диморфизмы, могла бы стать мощным инструментом для исследователей, которые иначе не хотели бы использовать женщин в своей работе. Хотя литература о влиянии цикла течки на поведение обычно используемых лабораторных животных остается относительно скудной, многие недавние исследования были направлены на решение этой устойчивой проблемы.

Обзор 293 журнальных статей, оценивающих поведенческие, морфологические, физиологические и молекулярные черты у самцов и самок мышей, показал, что самки не были значительно более вариабельны, чем самцы, по любому из оцениваемых показателей (Prendergast et al., 2014). Кроме того, обзор 311 журнальных статей Becker et al. (2016) обнаружили, что вариабельность функции мозга в нескольких областях существенно не различалась у самцов и самок крыс. Хотя эти обзоры не указали на значительную вариабельность поведения и функций мозга у мужчин и женщин, поведенческое исследование Meziane et al.(2007) обнаружили зависящий от штамма эффект изменчивости поведения на разных этапах цикла течки. В то время как самки мышей BALB / cByJ демонстрировали значительную поведенческую изменчивость в зависимости от стадии цикла течки в открытом поле, взмахах хвоста и подвешивании хвоста, самки мышей C57BL / 6J (C57) демонстрировали стабильное поведение в течение цикла течки на открытом воздухе. полевые тесты и тесты с подергиванием хвостом, но тест с подвешиванием за хвост показал явную изменчивость (Meziane et al., 2007).

Эти статьи дают представление о потенциальном влиянии цикла течки на поведенческую и неврологическую изменчивость самок животных, однако литература, в которой исследователи отслеживали цикл охоты на протяжении всего поведенческого тестирования, остается в лучшем случае скудной.Чтобы решить эту проблему вариабельности поведения в течение цикла течки, мы провели батарею поведенческих тестов с использованием свободно передвигающихся по циклу самок мышей C57, отслеживая их цикл эструса через вагинальный лаваж и цитологическую оценку (Рисунки 1A – E). Здесь мы сообщаем о влиянии пола (самцы мышей по сравнению с самками) и цикла течки на различные поведенческие задачи [трехкамерное социальное взаимодействие (SI), приподнятый крестообразный лабиринт (EPM), дырочная доска, распознавание новых объектов (NOR). ) и rotarod] обычно используются в лабораториях фенотипирования мышей для определения восприимчивости этого поведения к гормональным колебаниям.

Рисунок 1 . Хронология цикла течки мыши. Цикл течки мыши длится 2–8 дней, как показано на гистограмме, представляющей продолжительность цикла эструса для n = 41 самка мышей (E) и представлена ​​четырьмя отдельными стадиями: проэструс (A) , течка (B) , диэструс (C) и метструс (D) . Каждую стадию цикла различают с помощью цитологии влагалища и идентификации конкретных типов клеток (лейкоциты — желтая стрелка, ядросодержащие эпителиальные клетки — голубая стрелка, ороговевшие эпителиальные клетки — белая стрелка).Мыши в проэструсе и эструсе сексуально восприимчивы (SR), а мыши в диэструсе и метэструсе невосприимчивы (NR). (F) Временная шкала поведенческого тестирования показывает порядок выполнения поведенческих задач. Поведенческие задания на тревогу (красный) были сначала выполнены, чтобы предотвратить какое-либо влияние обработки на поведенческий результат. Затем последовали тесты на обучение и память (синий), а затем тесты на общительность (зеленый). Серые стрелки указывают на то, что последующая поведенческая задача была выполнена, по крайней мере, через 24 часа или неделю спустя.Черные стрелки означают, что следующая задача была выполнена, по крайней мере, через неделю или две недели. Синяя стрелка обозначает, что испытание вращающегося стержня было проведено через 24 часа после тренировки вращающегося стержня.

Методы

Животные

Мышей C57BL / 6J [Лаборатория Джексона (Бар-Харбор, Мэн, США)] содержали в однополых группах по 3–5 человек с доступной пищей и водой ad libitum . Мышей содержали в 12-часовом цикле свет / темнота (свет включается с 07:00 до 19:00) при 23 ° C и контролируемой влажности (45–55%).Все эксперименты были одобрены комитетом по уходу и использованию животных (IACUC) Детской больницы Бостона и проводились в соответствии со всеми руководящими принципами NIH по гуманному обращению с животными. Мышей тестировали по всем парадигмам поведения в период между 60 и 90 днями после рождения (P60–90). Самцов и самок мышей тестировали в разные дни, чтобы учесть чувствительность к феромонам во время поведенческого тестирования.

Идентификация стадии цикла эструса мыши

Мониторинг цикла течки и классификация стадий проводились с использованием влагалищной цитологии, описанной ранее (McLean et al., 2012). Стадии цикла течки определяли на основании наблюдения лейкоцитов, ороговевших эпителиальных клеток и ядерных эпителиальных клеток (Рисунки 1A – D, Byers et al., 2012). Мышей промывали ежедневно в течение 2 недель перед тестированием, чтобы убедиться, что график цикла течки был нормальным для каждой мыши. Цикл течки длился 2-8 дней, из которых 4 дня были наиболее частой продолжительностью цикла (рис. 1E). Затем сразу после каждого поведенческого теста у каждого животного брали лаваж. Применение лаважа после тестирования сводит к минимуму риск дополнительного стресса, который может повлиять на поведенческие характеристики животного (Ekambaram et al., 2017). Мышам была назначена стадия цикла течки на основе цитологической оценки, а затем они были делегированы в экспериментальную группу [сексуально-восприимчивую (течка и метеструс) и невосприимчивую (НР; диэструс и проэструс)] для каждого поведенческого теста (McLean et al., 2012 ).

Поведенческое тестирование

Все тесты, выбранные для исследования (за исключением теста с вращающимся стержнем, который проводился в течение 2 дней), не занимали несколько дней, поскольку стадия цикла течки может меняться с 1 дня на следующий.Всего 41 самка мышей и 18 самцов мышей были подвергнуты батарее тестов, выполненных в определенном порядке (рис. 1F). Некоторые поведенческие тесты не требовали использования всех 41 самки мышей, поскольку результаты этих тестов показали минимальную вариабельность в исследуемых когортах. Таким образом, не все женщины прошли все поведенческие тесты. Все мыши следовали одному и тому же порядку тестирования, но некоторые пропустили определенное поведение или закончили предыдущий поведенческий тест. Поскольку стадия цикла течки определялась сразу после каждого теста, все тесты проводились вслепую.Порядок тестирования не был рандомизирован по полу, чтобы предотвратить перекрестное заражение феромонами. Однако тестирование было рандомизировано для стадии цикла течки, поскольку не все мыши находились на одной и той же стадии в любой момент времени. Это также объясняет различное количество самок, использованных для каждого теста, поскольку самок может быть непропорционально отнесено к одной группе по сравнению с другой. Поэтому для некоторых тестов требовалось дополнительное количество самок мышей, чтобы сбалансировать две экспериментальные группы самок. Сначала были протестированы поведенческие задачи, связанные с тревогой, чтобы избежать влияния обработки на поведенческий результат мышей (рис. 1F).

Беспокойство

Elevated Plus Maze (EPM) и тестирование с помощью дырочной доски использовали для измерения тревожности у мышей. Эти тесты исследуют исследовательское поведение мышей в незнакомой среде, имитирующее то, что считается тревожным поведением у людей (Lezak et al., 2017). EPM предполагает размещение мыши на арене с двумя закрытыми и двумя открытыми руками (длиной 35 см) на высоте 50 см над полом на 5 мин. В конце каждого испытания лабиринт очищали с помощью Clidox для устранения запаха от предыдущей тестовой мыши.Исследовательское поведение регистрировалось и измерялось с помощью программного обеспечения Ethovision XT, v11.5 (Noldus, Нидерланды). Процент времени, проведенного с распростертыми объятиями, является индикатором беспокойства (рис. 2А).

Рисунок 2 . Цикл течки не влияет на тревожность. Аппарат для приподнятого крестообразного лабиринта. Мышь тратит 5 минут на исследование двух открытых рукавов без стен и двух закрытых рукавов, окруженных стенами. Чем больше времени проводит в открытых объятиях, тем меньше беспокойства и стресса мышь демонстрирует (A) .Аппарат для дырочной доски. Мышь тратит 15 минут, исследуя квадратную арену с исследовательскими отверстиями для сования носа. Чем больше общее время, пройденное расстояние и количество заходов в центр (заключено в красную рамку), тем меньше беспокойства у мыши. Более простые движения, вставание на дыбы и количество толчков указывают на большее исследовательское поведение (B) . Не было существенной разницы между женской и мужской группами в процентном отношении (%) времени, проведенного в открытых руках (C) .нс> 0,05.

Тест с дырочной доской состоял из квадратной арены (45 × 45 см) с девятью отверстиями в полу (рис. 2В). Два слоя инфракрасных лучей сформировали сетку по всей арене для измерения горизонтальной и вертикальной активности, а дальнейшие инфракрасные лучи, расположенные в отверстиях в полу, регистрируют, когда мышь просовывает нос в отверстие. Тестирование длилось 15 минут с записью различных параметров для оценки исследовательского поведения (дополнительная таблица S1). Между каждой мышью арену очищали с помощью Clidox.

Обучение и память

Распознавание новых объектов (NOR) рассматривается как краткосрочный тест для измерения рабочей памяти, не зависящей от гиппокампа (Cohen and Stackman, 2015). Мышей подвергали воздействию двух одинаковых белых пластиковых цилиндров на арене 40 × 40 см, пока они не исследовали оба объекта в течение 20 с. После 10-минутной задержки мышей возвращали на арену, где один из объектов был заменен цилиндром из синего стекла. Было записано время взаимодействия со знакомыми и новыми объектами (рис. 3А).Мыши исключались из тестирования с новым объектом, если они не достигли критерия 20-секундного времени исследования с идентичными объектами в течение 5-минутной продолжительности (Leger et al., 2013). Все действия записывались с помощью Ethovision XT v.11.5. Между каждой мышью арену очищали с помощью Clidox.

Рисунок 3 . Кратковременная память и моторное обучение не зависят от цикла течки. Хронология и аппарат для нового объекта. Мышь сначала приучает к двум идентичным объектам (испытание заканчивается через 20 секунд, потраченных на взаимодействие с обоими объектами).Через 10 минут мышь помещается обратно на арену новых объектов на 5 минут с новым объектом и одним из двух объектов, которые она приучила к (A) . Хронология и аппарат для задачи обучения моторики вращающегося стержня. Первоначально мышь приучает ходить на балке вращающегося стержня в течение 5 мин. Через 24 часа мышь подвергается пяти последовательным испытаниям, и время, проведенное на платформе перед падением, регистрируется в испытании (B) . Обе группы женщин и мужчин показали значительное предпочтение нового объекта перед знакомым объектом (C) .В задаче с вращающимся стержнем все группы проводили больше времени на вращающемся стержне от одного испытания к другому, как и ожидалось для мышей C57, и не показали значительной разницы между собой по времени, проведенному на вращающемся стержне в каждом испытании (D) . ** <0,005.

Моторное обучение измерялось с помощью теста вращающегося стержня (Shiotsuki et al., 2010). В день 1 мышей тренировали бегать на вращающейся балке [четыре оборота в минуту (об / мин)] в течение 5 минут. После 24-часовой задержки мышей помещали на движущийся луч, который ускорялся на 1 об / мин с начальной скорости 4 об / мин.Тестирование повторяли пять раз (интервал между испытаниями 3 мин), и время ожидания до падения луча регистрировалось для каждого из пяти испытаний, а среднее значение пяти испытаний принималось в качестве значения эффективности (рис. 3В). Оборудование очищали с помощью Clidox перед каждой тестируемой мышью.

Общительность

Общительность была измерена с помощью 3-х камерной задачи социального подхода (рис. 4A). Протокол эксперимента был адаптирован из Yang et al. (2011). Мышей приучали в течение 5 мин к арене 60 × 40 см, разделенной на три камеры двумя панелями.Левая и правая камеры содержали пустую клетку в одном углу. Затем мышей возвращали в среднюю камеру и блокировали из левой и правой камеры, в то время как новую мышь случайным образом помещали в левую или правую камеру клетки. Новая мышь была того же пола, возраста (P60–90) и линии и не была родным братом тестируемой мыши. После того, как новая мышь была представлена, испытуемой мыши позволяли исследовать все три камеры в течение 10 минут. Арену очищали с помощью Clidox между тестами каждой мыши, чтобы удалить мочу и любой запах от предыдущего теста и новой мыши.Чтобы изучить влияние удаления запаха и тактильных сигналов на SI, был разработан протокол визуального SI, который немного отличался от трехкамерного социального подхода. Это было сделано путем помещения новой мыши в закрытую клетку, а не в клетку с решетками, которая использовалась для первоначальной трехкамерной задачи. Повторный тест на трехкамерный социальный подход проводился по крайней мере через 2 недели после первого трехкамерного социального подхода или по крайней мере через 1 неделю после завершения визуального социального подхода (рис. 1F). Поведение записывалось с помощью видеокамеры и отслеживалось с помощью Ethovision XT, v11.5 (Noldus, Нидерланды).

Рисунок 4 . Влияние цикла течки на социальное поведение самок мышей C57BL / 6J. Аппарат для 3-х камерного социального взаимодействия (СИ). Клетки для SI традиционно имеют номер (A) . В задании SI самки и самцы NR демонстрируют значительное предпочтение новой однополой мыши по сравнению с клеткой без мыши. Сексуально восприимчивые (SR) самки не отдают предпочтения новой клетке для мышей или клетке без мыши (B) . В визуальной задаче SI, где клетки закрыты, а не ограничены, самки SR по-прежнему демонстрируют отсутствие предпочтения новой мыши по сравнению с клеткой без мыши (C) .Десять самок мышей были повторно протестированы во второй раз в SI, чтобы сравнить время взаимодействия при NR и SR. Двухфакторный дисперсионный анализ с повторными измерениями использовали с тестом post hoc Бонферрони для сравнения времени взаимодействия с новой мышью и без мыши для каждой группы (D) . Для определения различий в обнаружении запаха между самками NR и SR использовался тест на привыкание / исчерпание обоняния. Мышь подвергается воздействию ватных палочек с запахом в приученной клетке. Самки SR и NR не демонстрируют значительной разницы в обнаружении запаха для дистиллированной воды (H ₂ O), экстракта миндаля и запаха у новой, незнакомой мыши одного пола (E) .** <0,005, **** <0,0001, нс> 0,05.

Распознавание запахов было проверено с помощью теста обонятельного привыкания / дисхабитуации (рис. 4E; Yang and Crawley, 2009). Мышь помещают в пустую домашнюю клетку с чистой деревянной подстилкой и дают возможность акклиматизироваться в течение 30 мин. Затем мышь ощущают запах на ватной палочке в течение 2 минут, после чего следует 1-минутный интервал между испытаниями. Каждый тип запаха присутствует три раза подряд до появления следующего типа запаха. Типы запаха были представлены в следующем порядке: дистиллированная вода (H ₂ O), разведение миндального экстракта 1: 100 и незнакомая мышь того же пола.Запах от незнакомой мыши был получен путем протирания подстилки клетки незнакомой мыши ватной палочкой. Поведение было записано через видеокамеру , и секундомер использовался для отслеживания количества времени, которое мышь потратила на нюхание запаха.

Статистика

Статистический анализ был выполнен с использованием GraphPad Prism (Prism 7). Данные представлены как среднее значение ± стандартная ошибка среднего (SEM). Чтобы изучить значимые различия между средними значениями, для повторного SI использовался двухфакторный дисперсионный анализ (ANOVA) с повторными измерениями (RM).Односторонний дисперсионный анализ был использован для EPM и дырочной доски, а односторонний — с RM для вращающегося стержня. Парные студенческие t -тесты использовались для 3-х камерного социального подхода и НОР. Post hoc тесты включали тесты Бонферрони в повторный SI. Тест множественных сравнений Тьюки использовался после всех односторонних дисперсионных анализов.

Результаты

Учитывая, что определенные поведенческие феномены могут различаться между полами и в течение цикла течки у самок, мы стремились исследовать вклад стадии цикла течки в поведенческие изменения у мышей.Мы протестировали самок мышей в течение цикла течки и самцов мышей в различных поведенческих задачах, которые измеряют тревожность, обучение, память и общительность.

Цикл течки у грызунов

Мы охарактеризовали стадию цикла течки у самок мышей, взяв образцы из влагалища сразу после каждой поведенческой задачи и изучив их цитологию под микроскопом. Каждая стадия была охарактеризована на основе доли лейкоцитов, ороговевших эпителиальных клеток и ядерных эпителиальных клеток (Рисунки 1A – D).На стадии проэструса в цикле течки преобладают ядросодержащие эпителиальные клетки, тогда как ороговевшие эпителиальные клетки в большом количестве присутствуют на стадии течки. Стадия метеструса представляет собой смесь всех трех типов клеток, но в основном состоит из ороговевших эпителиальных клеток. Стадия диэструса также показывает смесь всех типов клеток с наибольшей долей лейкоцитов. Развитие цикла предполагает, что лейкоциты агрегируются во время диэструса и исчезают с началом проэструса. Во время проэструса появляются ядерные эпителиальные клетки, которые заменяются ороговевшими эпителиальными клетками, когда мыши входят в стадию течки.При метеструсе инвазия лейкоцитов начинается и продолжается до диэструса (McLean et al., 2012). Мышей, у которых было обнаружено проэструс и эструс, помещали в одну группу, а мышей в диэструсе и метэструсе объединяли в другую группу для целей анализа, поскольку первая группа считается восприимчивой к самцам, а вторая — нет.

Беспокойство

Мы сначала проверили половые различия, связанные с тревогой, поскольку влияние цикла течки на тревожность остается неубедительным в литературе.Более того, поведенческие задачи, связанные с тревогой, чувствительны к решению и поэтому должны выполняться раньше других тестов. Самцов и самок мышей тестировали на EPM в качестве теста на тревожность (Rodgers and Johnson, 1995; Lezak et al., 2017). Не было значительной разницы в процентном соотношении времени, проведенного в открытых объятиях между сексуально восприимчивыми самками, самками NR и самцами ( F _(2,44) = 0,5130, p = 0,4888; Рисунок 2C). Кроме того, мы протестировали мышей на доске с отверстиями — поведенческая задача, измеряющая несколько типов поведения, включая тревожность и исследовательскую активность.Не было существенной разницы в доске с отверстиями по всем параметрам ( p > 0,05), за исключением количества толчков в центральной зоне. Наблюдалась значительная разница в количестве ударов в центр арены ( F _(2,52) = 4,771, p = 0,0125) и post hoc тесты показали, что количество ударов в Центральная зона различалась между мужчинами и сексуально восприимчивыми женщинами, а также между мужчинами и женщинами NR (дополнительная таблица S1).В целом, результаты не показывают различий в уровне тревожности у самок на разных этапах цикла течки и в зависимости от пола.

Обучение и память

Учитывая, что эстроген может модулировать кратковременную память и обучение посредством активации рецепторов эстрогена , мы попытались выяснить, проявляют ли женщины различия в обучении и памяти в течение цикла течки (Liu et al., 2008; Frick, 2009; Han et al. др., 2013; Бин и др., 2015). Мышей тестировали в задаче NOR на краткосрочную негиппокампальную память и в задаче Rotarod для моторного обучения.Не было разницы между мужчинами и женщинами в NOR ( F _(2,106) = 0,2567, p = 0,7742). Существенная разница между временем, проведенным с новым предметом, и временем, проведенным со знакомым предметом, была обнаружена для каждой группы: сексуально восприимчивые женщины ( t ₍₁₇₎ = 3,3, p <0,005), женщины NR ( t ₍₁₃₎ = 5,74, p <0,005) и мужчины ( t ₍₁₇₎ = 3,72, p <0.005; Рисунок 3C).

Что касается моторного обучения, наблюдалась значительная разница между испытаниями для сексуально восприимчивых женщин ( F _{(2,827,36,75)} = 6,934, p = 0,001), NR женщин ( F _{(3,449, 48,29)} = 6,959, p = 0,0003) и для мужчин ( F _{(2,784,47,32)} = 5,806, p = 0,0023; рисунок 3D).

Взаимодействие с социальными сетями

Наконец, мы проверили мышей на предмет половых различий в SI.Цикл течки хорошо известен в модулировании сексуального поведения и может влиять на то, как мышь приближается к новой мыши того же или разного пола (Kim et al., 2016). Мы использовали трехкамерную задачу социального подхода, чтобы определить коммуникабельность наших тестовых мышей с новой мышью того же пола. Мы обнаружили, что самки NR выполняли эту задачу аналогично самцам, показывая большее время взаимодействия с новой мышью по сравнению с пустой клеткой (самки NR: t ₍₂₀₎ = 5,123, p <0.0001, мужчины: т ₍₁₇₎ = 6,575, р <0,0001). Напротив, сексуально восприимчивые самки не показали разницы во времени взаимодействия между новой мышью и пустой клеткой ( t ₍₁₄₎ = 1,475, p = 0,1624; Рисунок 4B). Обнаружив это различие, мы сначала проверили, связано ли различие в предпочтении новой мыши с различиями в обонятельном восприятии между сексуально восприимчивыми и NR самками. Это было сделано с помощью задачи обонятельного привыкания / дискриминации, где мы обнаружили, что как сексуально-восприимчивые, так и NR-самки одинаково реагировали на представление разных запахов ( p > 0.05 за каждый запах; Рисунок 4E). Затем мы протестировали эффект удаления запаха и тактильных сигналов, поместив новую мышь под клетку из прозрачного твердого акрила (по сравнению со стандартной клеткой из акриловых стержней). Время взаимодействия с новой мышью по сравнению с пустой клеткой существенно не отличалось ( t ₍₁₁₎ = 2,028, p = 0,0675) у сексуально восприимчивых самок, когда была представлена ​​только визуальная подсказка новой мыши. и как обонятельные, так и тактильные сигналы новой мыши были исключены.Самки NR продолжали демонстрировать значительное предпочтение новой мыши пустой клетке в отсутствие тактильных сигналов и запахов ( t ₍₁₆₎ = 5,364, p <0,0001; Рисунок 4C). Эти данные предполагают, что разница в SI между сексуально восприимчивыми и NR самками не зависит от запаха или тактильных сигналов от новой мыши, а скорее от визуальных сигналов. Наконец, мы подтвердили, что эта разница в производительности SI присутствует у отдельных мышей, когда они переключаются между стадиями.Мышей тестировали дважды, в частности, во время NR и стадии сексуальной восприимчивости, и каждый раз с отдельной новой мышью. Здесь имеется значительное предпочтение новой мыши по сравнению с клеткой без мыши, когда самки были NR и когда они были сексуально восприимчивы ( F _(1,18) = 9,731, p = 0,0059). Однако апостериорное тестирование показало значительный эффект восприимчивости, так что самки NR больше взаимодействовали с новой мышью, чем когда они были сексуально восприимчивыми (SR; p = 0.0026; Рисунок 4D). Эти результаты приводят к выводу, что существует разница в социальных предпочтениях самок новой однополой мыши в течение всего цикла течки. Кроме того, это различие может быть связано с визуальными сигналами новой мыши и не зависит от запаха и тактильных сигналов.

Обсуждение

Наш основной вывод состоит в том, что сексуально восприимчивые самки мышей не показывают статистически значимого предпочтения новой мыши по сравнению с пустым вольером. Это прямо контрастирует с самками и самцами NR, которые вместо этого проводят больше времени, исследуя новую мышь.Эти результаты не были связаны с различиями в обонятельном восприятии, потому что как рецептивные, так и NR мыши выполняли задачу обонятельной дискриминации / привыкания одинаково (рис. 4E). Не было различий между экспериментальными группами в отношении поведенческих характеристик в любом из других проанализированных нами тестов, что свидетельствует об отсутствии различий в тревожности, краткосрочной негиппокампальной рабочей памяти и моторном обучении.

Беспокойство часто сопутствует половым различиям людей и связано с ними.У женщин частота тревожных симптомов в два раза выше, чем у мужчин (Nolen-Hoeksema, 2001; Bekker and van Mens-Verhulst, 2007). Воспроизводимость этого смещения у грызунов остается спорной, в первую очередь потому, что тревожность как симптомы дифференцированных между полом не может быть воспроизведена на животных моделей (Лезак и др., 2017). Есть отчеты, описывающие эксперименты, в которых оценивалась половая предвзятость моделей грызунов в контексте тревожного поведения. Однако противоречивые выводы о предвзятости пола в этих экспериментах затрудняют предположение о том, демонстрируют ли грызуны половые различия в отношении такого поведения (Donner and Lowry, 2013; Mehta et al., 2013; Кокрас и др., 2015). На чувствительность к лекарствам также может влиять цикл. Действительно, Picard et al., 2019 недавно показали, что самки C57Bl6 / J во время течки не реагируют на низкие дозы кетамина, в то время как самки NR реагируют и демонстрируют ответ, сравнимый с самцами.

Наши результаты отличаются от предыдущих исследований тревожности, которые могли быть подвержены влиянию промываний на стресс самок грызунов (Gouveia et al., 2004; D’Souza and Sadananda, 2017). Подобно нашим результатам, Meziane et al.(2007) и Bath et al. (2012) не обнаружили различий между стадиями цикла течки мышей C57 по EPM и поведенческим характеристикам открытого поля, когда лаваж проводился в течение 10 минут после окончания тестирования. Эти результаты совпадают с результатами, представленными здесь, и предполагают, что самки грызунов не проявляют особых различий в тревожности в течение цикла течки и по сравнению с самцами. Наше исследование дырочной доски действительно обнаружило существенные различия между полами в отношении ударов в центральной зоне. Однако остальные параметры, измеренные для дырочной доски, существенно не изменились, что свидетельствует о том, что сексуальная восприимчивость не оказывает сильного влияния на исследовательский драйв.

Не было заметного влияния цикла течки на кратковременную рабочую память у мышей. Поскольку исследования обнаружили критическое окно для модуляции кратковременной памяти в отношении активации рецепторов эстрогена, цикл течки может не влиять на поведение на более поздних этапах жизни грызунов, включая P60–90, когда мы тестировали наших мышей (Bean et al., 2015 ). Возможно, уровни эстрогена в течение цикла течки недостаточно высоки для активации рецепторов эстрогена в переднем мозге. В предыдущих исследованиях, в которых эстроген применялся экзогенно для лечения снижения когнитивных функций, эти методы лечения проводились либо на овариэктомированных, либо на старых мышах.Повышенные уровни после экзогенного лечения могут превышать базальные уровни эстрогена на типичных стадиях цикла течки, но не измерялись ни в одном из описанных исследований (Liu et al., 2008; Frick, 2009; Han et al., 2013; Bean et al. ., 2015). Обычно уровни эстрогена в фазах низкой восприимчивости (диэструс и метэструс) ниже, чем в фазах высокой восприимчивости (течка и проэструс), но не устраняются (McLean et al., 2012). Следовательно, было бы интересно количественно оценить активацию рецептора эстрогена с помощью базальных уровней эстрогена для каждой стадии цикла по сравнению с активацией при лечении эстрогеном.В совокупности это новые подходы, которые мы можем использовать для определения степени гормональных изменений в течение цикла течки в краткосрочной негиппокампальной памяти.

Результаты исследования вращающихся стержней совпадают с предыдущими исследованиями моторного обучения, в которых на поведенческие характеристики не влияли разные стадии цикла течки и пол (Meziane et al., 2007). Исходя из этих результатов, колебания гормонов во время цикла течки недостаточно сильны, чтобы повлиять на двигательное обучение. Экзогенное введение гормонов может стимулировать активацию обучения при выполнении двигательных задач, но здоровые женщины не демонстрируют различий в моторном обучении по сравнению с мужчинами на разных стадиях цикла течки (Morgan and Pfaff, 2001; Ogawa et al., 2003). Поскольку локомоция в задании с дырочками не различалась у сексуально восприимчивых и NR самок и самцов, результаты ротарода зависели от моторного обучения, а не от двигательной активности (дополнительная таблица S1).

Как правило, исследования социального поведения грызунов сосредоточены на влиянии гормонов вазопрессина и окситоцина. Однако важно учитывать различия в социальном поведении в отношении гормональных колебаний, происходящих в течение цикла течки, из-за их влияния на сексуальное поведение.Поведение самцов мышей C57Bl6 / J на ​​самок значительно выше, когда самки находятся в эструсе, чем в диэструсе, что свидетельствует о том, что сексуальная восприимчивость совпадает с брачным поведением (Powers, 1970; Kim et al., 2016). Ограниченное количество исследований показало влияние цикла течки на социальное поведение. Одно из таких исследований было сосредоточено на аспекте социального обучения, в котором мышь проявляет предпочтение к пище, которое ранее определялось по дыханию сородича (Ervin et al., 2015). Во время сексуально восприимчивой стадии проэструса цикла течки самка мыши будет проявлять больше предпочтения к пище, которую она распознает от своего вида, чем мышь в диэструсе NR (Choleris et al., 2011). В наших экспериментах мы хотели отделить влияние цикла течки на память от общительности. Однако для будущих экспериментов было бы интересно рассмотреть влияние на социальную память, например, в трехкамерной задаче социального распознавания (Yang et al., 2011). Если сексуально восприимчивые самки все еще могут различать знакомых и новых мышей в этой задаче, но демонстрируют пониженную коммуникабельность, то это будет соответствовать нашим результатам по обучению, памяти и общительности.

Мы предполагаем, что мышь SR с меньшей вероятностью будет взаимодействовать с новой мышью того же пола, учитывая, что мышь подготовлена ​​к размножению и будет активно искать сексуального партнера (Kim et al., 2016). Это не относится к мышам NR, возможно, потому, что их мотивация к социальной новизне перевешивает их мотивацию к поиску партнера. Недавнее исследование показало, что повышенный уровень эстрогена может воздействовать на соматосенсорную кору, увеличивая возбудимость парвальбумина (ПВ) интернейронов с быстрым выбросом парвальбумина (Clemens et al., 2019). Эта роль эстрогена потенциально может распространяться на другие области коры головного мозга, такие как первичная зрительная кора. Мы, следовательно, также предполагаем, что цикл течки может влиять на зрительную корковую активность во время SI, так что гормональный профиль во время сексуальной восприимчивости регулирует возбуждение PV нейронов.

Чувствительность социального поведения к циклу течки может иметь последствия для нарушений развития нервной системы и психоневрологических заболеваний. Традиционно трехкамерный социальный подход использовался для выявления дефицита общительности в мышиных моделях аутизма, включая синдром ломкой Х-хромосомы, синдром Ретта и делецию 16p11.2 (Moretti and Zoghbi, 2006; Dahlhaus, 2018; Stoppel et al., 2018). Самок мышей обычно исключают из социальных поведенческих задач, но тестирование самок с помощью этих моделей может пролить свет на половой диморфизм общительности при расстройствах аутистического спектра (РАС; Silverman et al., 2010). Дефицит SI между полами также был продемонстрирован в контексте аутизма, но сексуальная восприимчивость может быть фактором, который по-разному регулирует общительность и дополнительно требует мониторинга цикла течки мыши (Jeon et al., 2018). Цикл течки следует рассматривать как продвижение вперед в будущих экспериментах на моделях мышей с аутизмом.

Учитывая штамм-зависимые эффекты цикла течки, обнаруженные Meziane et al. (2007) в своем исследовании мы признаем, что использование одной линии мышей (C57BL / 6J) представляет собой важное ограничение наших результатов.Кроме того, классификация мышей как SR в проэструсе и эструсе и NR в метеструсе и диэструсе ограничивает детализацию нашего анализа, особенно в отношении наших результатов в отношении SI. В будущем можно будет устранить эти ограничения при изучении поведенческих воздействий отдельных гормонов, которые колеблются на протяжении цикла течки.

В то время как самки животных по-прежнему недостаточно представлены в биомедицинских исследованиях из-за беспокойства по поводу изменчивости, вызванной циклом течки, литература, изучающая связь между циклическим циклом женских гормонов и изменчивостью во многих областях, остается скудной.Описанные здесь исследования с использованием мышей C57BL / 6J предполагают, что гормональный цикл может быть ответственным за различия в SI в трехкамерном тесте социального подхода, но лежащий в основе механизм требует дальнейшего изучения. В этих экспериментах мы изучили только одну распространенную линию мышей, и расширение диапазона этих линий будет полезным. Обширная литература по изменчивости, вызванной циклом течки у разных видов и между штаммами, может стать мощным инструментом для исследователей. Такая литература позволит исследователям учесть потенциальную изменчивость, вызванную циклом течки, и позволит более полно реализовать Закон NIH Revitalization Act.

Заявление о доступности данных

Необработанные данные, подтверждающие выводы этой статьи, будут предоставлены авторами без излишних оговорок.

Заявление об этике

Исследование на животных было рассмотрено и одобрено Комитетом по уходу и использованию животных Детской больницы Бостона.

Авторские взносы

TC и SG провели все поведенческие экспериментальные и вагинальные цитологические исследования. NA помог с некоторыми поведенческими экспериментами.TC проанализировал большую часть данных и написал статью. SG предоставил дополнительный текст и анализ к статье. NA и MF предоставили дополнительную информацию к статье и исправлениям. TC, SG, NA и MF внесли свой вклад в написание. TC и SG выполнили сбор экспериментальных данных. Н.А. и М.Ф. задумали первоначальную идею.

Финансирование

Работа, о которой сообщается, была выполнена в Центре нейроразвития поведения, Бостонской детской больнице, США, при поддержке гранта IDDRC (1U54HD0).

Конфликт интересов

Авторы заявляют, что исследование проводилось при отсутствии каких-либо коммерческих или финансовых отношений, которые могут быть истолкованы как потенциальный конфликт интересов.

Благодарности

Мы хотим поблагодарить Натали Пикард из лаборатории Fagiolini (Бостонская детская больница, США) за руководство по оценке цикла течки у мышей.

Дополнительные материалы

Дополнительные материалы к этой статье можно найти в Интернете по адресу: https: // www.frontiersin.org/articles/10.3389/fnbeh.2020.00113/full#supplementary-material.

Список литературы

Bath, K. G., Chuang, J., Spencer-Segal, J. L., Amso, D., Altemus, M., McEwen, B. S., et al. (2012). Вариантный полиморфизм нейротрофического фактора головного мозга (Valine66Methionine) вносит вклад в специфическое для стадии развития и эстрального периода проявление тревожно-подобного поведения у самок мышей. Biol. Психиатрия 72, 499–504. DOI: 10.1016 / j.biopsych.2012.03.032

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Бин, Л.A., Kumar, A., Rani, A., Guidi, M., Rosario, A.M., Cruz, P.E. и др. (2015). Повторное открытие критического окна для терапии эстрогенами. J. Neurosci. 35, 16077–16093. DOI: 10.1523 / jneurosci.1890-15.2015

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Беккер, Дж. Б., Прендергаст, Б. Дж., И Лян, Дж. У. (2016). Самки крыс не более изменчивы, чем самцы: метаанализ нейробиологических исследований. Biol. Половые различия. 7:34. DOI: 10.1186 / s13293-016-0087-5

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Беккер, М.Х. и ван Менс-Верхюльст Дж. (2007). Тревожные расстройства: половые различия в распространенности, степени и происхождении, но лечение нейтрально с гендерной точки зрения. Генд. Med. 4, S178 – S193. DOI: 10.1016 / s1550-8579 (07) 80057-x

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Холерис, Э., Клиппертон-Аллен, А. Э., Грей, Д. Г., Диас-Гонсалес, С., и Уэлсман, Р. Г. (2011). Дифференциальные эффекты антагонистов дофаминовых рецепторов D1-типа и D2 и фазы эстрального цикла на социальное обучение пищевых предпочтений, кормление и социальные взаимодействия у мышей. Нейропсихофармакология 36, 1689–1702. DOI: 10.1038 / npp.2011.50

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Клеменс, А. М., Леншоу, К., Бид, П., Лансян, Л., Саммонс, Р., Науманн, Р. К. и др. (2019). Регуляция эструса торможения коры. Curr. Биол. 29, 605.e6–615.e6. DOI: 10.1016 / j.cub.2019.01.045

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Коэн, С. Дж., И Стакман, Р. В.Младший (2015). Оценка участия гиппокампа грызунов в задаче распознавания нового объекта. Обзор. Behav. Brain Res. 285, 105–117. DOI: 10.1016 / j.bbr.2014.08.002

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

D’Souza, D., and Sadananda, M. (2017). Зависимые от фазы эстрального цикла изменения тревожных и депрессивных профилей у крыс Wistar-Kyoto в позднем подростковом возрасте. Ann. Neurosci. 24, 136–145. DOI: 10.1159 / 000477151

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Экамбарам, Г., Кумар, С. К. С., Джозеф, Л. Д. (2017). Сравнительное исследование по оценке эстрального цикла у мышей методом визуального и вагинального лаважа. J. Clin. Диаг. Res. 11, AC05 – AC07. DOI: 10.7860 / jcdr / 2017 / 23977.9148

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Эрвин, К. С. Дж., Лаймер, Дж. М., Матта, Р., Клиппертон-Аллен, А. Э., Кавальерс, М., и Холерис, Э. (2015). Участие эстрогенов в социальном поведении у грызунов: быстрые и долгосрочные действия. Horm.Behav. 74, 53–76. DOI: 10.1016 / j.yhbeh.2015.05.023

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Фрик, К. М. (2009). Эстрогены и возрастное снижение памяти у грызунов: чему мы научились и куда мы идем дальше? Horm. Behav. 55, 2–23. DOI: 10.1016 / j.yhbeh.2008.08.015

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Gouveia, A. Jr., душ Сантуш, U. D., Felisbino, F. E., de Afonseca, T. L., Antunes, G., и Морато, С. (2004). Влияние поведения цикла течки на поведение крыс в приподнятом Т-лабиринте. Behav. Процессы 67, 167–171. DOI: 10.1016 / j.beproc.2004.03.018

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Хан, X., Энлле, К. К., Бин, Л. А., Рани, А., Семпл-Роуленд, С. Л., Кумар, А., и др. (2013). Роль рецепторов эстрогена α и β в сохранении функции гиппокампа при старении. J. Neurosci. 33, 2671–2683.DOI: 10.1523 / JNEUROSCI.4937-12.2013

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Jeon, S. J., Gonzales, E. L., Mabunga, D. F. N., Valencia, S. T., Kim, D. G., Kim, Y., et al. (2018). Поведенческие особенности моделей грызунов с расстройством аутистического спектра, специфичные для пола. Exp. Neurobiol. 27, 321–343. DOI: 10.5607 / en.2018.27.5.321

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Килкенни, К., Браун, У. Дж., Катхилл, И. К., Эмерсон, М., Альтман, Д. Г. (2010). Улучшение отчетности об исследованиях в области биологических наук: руководство ARRIVE по отчетности об исследованиях на животных. PLoS Biol. 8: e1000412. DOI: 10.1371 / journal.pbio.1000412

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Ким, Х., Сон, Дж., Ю, Х., Ким, Х., О, Дж., Хан, Д. и др. (2016). Влияние эстрального цикла самок на сексуальное поведение и ультразвуковые вокализации самцов мышей C57BL / 6 и мышей BTBR T + tf / J с аутизмом. Exp.Neurobiol. 25, 156–162. DOI: 10.5607 / en.2016.25.4.156

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Кокрас, Н., Антониу, К., Михаил, Х. Г., Кафецопулос, В., Пападопулу-Дайфоти, З., и Далла, К. (2015). Тест принудительного плавания: а как насчет женщин? Нейрофармакология 99, 408–421. DOI: 10.1016 / j.neuropharm.2015.03.016

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Leger, M., Quiedeville, A., Bouet, V., Haelewyn, B., Boulouard, M., Schumann-Bard, M., et al. (2013). Тест распознавания объектов на мышах. Нац. Protoc. 8, 2531–2537. DOI: 10.1038 / nprot.2013.155

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Лезак, К. Р., Пропавший, Г., и Карлезон, В. А. младший (2017). Поведенческие методы исследования тревожности у грызунов. Dialogues Clin. Neurosci. 19, 181–191.

PubMed Аннотация | Google Scholar

Лю Ф., Дэй М., Муньис Л. К., Битран Д., Ариас Р., Ревилла-Санчес Р. и др. (2008). Активация рецептора эстрогена-β регулирует синаптическую пластичность гиппокампа и улучшает память. Нац. Neurosci. 11, 334–343. DOI: 10.1038 / nn2057

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Маклин, А.С., Валенсуэла, Н., Фай, С., и Беннет, С.А. (2012). Проведение вагинального лаважа, окрашивания кристаллическим фиолетовым и цитологического анализа влагалища для определения стадии эстрального цикла мышей. Дж.Vis. Exp. 67: e4389. DOI: 10,3791 / 4389

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Мехта, Н. С., Ван, Л., и Редей, Э. Э. (2013). Половые различия в депрессивном, тревожном поведении и уровнях транскрипции гиппокампа в генетической модели крыс. Genes Brain Behav. 12, 695–704. DOI: 10.1111 / gbb.12063

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Meziane, H., Quagazzal, A.M, Aubert, L., Wietrzych, M., and Krezel, W.(2007). Влияние эстрального цикла на поведение самок мышей C57BL / 6J и BALB / cByJ: значение для стратегий фенотипирования. Genes Brain Behav. 6, 192–200. DOI: 10.1111 / j.1601-183x.2006.00249.x

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Нолен-Хуксема, С. (2001). Гендерные различия при депрессии. Curr. Реж. Psychol. Sci. 10, 173–176. DOI: 10.1111 / 1467-8721.00142

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Огава, С., Чан, Дж., Густафссон, Дж., Корах, К. С., и Пфафф, Д. В. (2003). Эстроген увеличивает двигательную активность у мышей за счет специфичности рецептора эстрогена a: для данного типа активности. Эндокринология 144, 230–239. DOI: 10.1210 / en.2002-220519

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Пикард, Н., Такесиан, А. Э., Фаджиолини, М., и Хенш, Т. К. (2019). Рецепторы NMDA 2A в клетках парвальбумина опосредуют быструю реакцию кетамина на корковую активность, специфичную для пола. Мол. Психиатрия 24, 828–838. DOI: 10.1038 / s41380-018-0341-9

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Прендергаст, Б. Дж., Ониши, К. Г., и Цукер, И. (2014). Самки мышей освобождены для включения в нейробиологические и биомедицинские исследования. Neurosci. Biobehav. Ред. 40, 1–5. DOI: 10.1016 / j.neubiorev.2014.01.001

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Роджерс, Р. Дж., И Джонсон, Н. Дж. Т. (1995).Факторный анализ пространственно-временных и этологических показателей в тесте тревоги с приподнятым крестообразным лабиринтом на мышах. Pharmacol. Biochem. Behav. 52, 297–303. DOI: 10.1016 / 0091-3057 (95) 00138-м

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Шиоцуки, Х., Йошими, К., Шимо, Ю., Фунаяма, М., Такамацу, Ю., Икеда, К., и др. (2010). Тест Rotarod для оценки обучения двигательным навыкам. J. Neurosci. Методы 189, 180–185. DOI: 10.1016 / j.jneumeth.2010.03.026

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Стоппель, Л. Дж., Каздоба, Т. М., Шаффлер, М. Д., Преза, А. Р., Хейнен, А., Кроули, Дж. Н. и др. (2018). R-баклофен устраняет когнитивный дефицит и улучшает социальное взаимодействие у двух линий мышей с делецией 16p11.2. Нейропсихофармакология 43, 513–524. DOI: 10.1038 / npp.2017.236

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Янг, М., Сильверман, Дж. Л., и Кроули, Дж. Н. (2011). Автоматизированная трехкамерная задача социального подхода для мышей. Curr. Protoc. Neurosci. Глава 8: Раздел 8.26. DOI: 10.1002 / 0471142301.ns0826s56

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

определение течки по The Free Dictionary

es · trus

Периодическое состояние сексуального возбуждения у самок большинства млекопитающих, за исключением людей, которое непосредственно предшествует овуляции и во время которого самка наиболее восприимчива к спариванию; нагревать.

Словарь английского языка American Heritage®, пятое издание. Авторские права © 2016 Издательская компания Houghton Mifflin Harcourt. Опубликовано Houghton Mifflin Harcourt Publishing Company. Все права защищены.

estrus

ˈestrous , ˈestrual adj

Collins English Dictionary — Complete and Unabridged Publishers, 12th Edition 2014 © Collins English Dictionary — Complete and Unabridged Publishers, 12th Edition 2014 © 1994, 1998, 2000, 2003, 2006, 2007, 2009, 2011, 2014

es • trus

повторяющийся период максимальной сексуальной восприимчивости у большинства самок млекопитающих, кроме человека; нагревать.